鄭麗雪 ，齊斌 ，梅艷珍 ，王立梅

（1.常熟理工學院生物與食品工程學院，江蘇 常熟 215500；2.常熟理工學院發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，江蘇 常熟 215500）

L-Cys與葡萄糖對酵母發(fā)酵合成谷胱甘肽的影響

鄭麗雪1，2，齊斌1，2，梅艷珍1，2，王立梅1，*

（1.常熟理工學院生物與食品工程學院，江蘇 常熟 215500；2.常熟理工學院發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，江蘇 常熟 215500）

通過在7.5 L發(fā)酵罐中，分別以流加葡萄糖和L-半胱氨酸與流加葡萄糖協(xié)同作用2種方式研究了酵母對分批發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的影響。結(jié)果表明，從第7 h開始恒速[1.5 g/（L·h）]流加葡萄糖直至發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵24 h后GSH產(chǎn)量達最大，為151.6 mg/L，比流加前提高37%。在恒速流加葡萄糖基礎上，當發(fā)酵至12 h，向發(fā)酵罐中一次性添加3 mmol半胱氨酸，最終GSH產(chǎn)量達最大，為213.3 mg/L，比分批發(fā)酵提高了93%。

谷胱甘肽；分批發(fā)酵；流加葡萄糖；半胱氨酸

還原型谷胱甘肽（簡稱GSH）是生物體內(nèi)重要的生物活性物質(zhì)[1]，廣泛存在于動、植物及微生物細胞內(nèi)。GSH作為一種抗氧化劑，能夠消除掉人體內(nèi)的自由基，清潔和凈化人體內(nèi)環(huán)境，在醫(yī)藥、保健品、功能性食品、化妝品等方面具有廣泛的應用前景[2]。

GSH的生產(chǎn)方法主要有：（1）萃取法[3]：此方法生產(chǎn)步驟繁雜，總收率很低。（2）化學合成法[4]：生產(chǎn)成本高、反應復雜耗時、產(chǎn)品純度不高，并且存在環(huán)境污染問題。（3）酶法[5]：由于需要獲得相關(guān)酶系、消耗昂貴的ATP以及加入前體氨基酸，因此生產(chǎn)成本較高。（4）酵母發(fā)酵法[6-9]：由于此法操作簡單，原料來源豐富，是目前最受歡迎方法之一，研究主要集中于菌種選育、發(fā)酵條件優(yōu)化。高密度發(fā)酵生產(chǎn)GSH的工藝條件有待進一步深入，是研究的難點之一。

利用7.5 L發(fā)酵罐研究半胱氨酸及流加葡萄糖對釀酒酵母分批發(fā)酵生產(chǎn)GSH的影響，為進一步放大實驗和工業(yè)化生產(chǎn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 菌種

經(jīng)亞硝基胍誘變選育的釀酒酵母Y518：常熟理工學院發(fā)酵工程技術(shù)研究中心保存。

1.2 儀器

Bioflo 110型7.5 L生物發(fā)酵罐：美國新布朗什維克科學公司；CR22GII型高速冷凍離心機：日本日立公司；UV-2450型紫外分光光度計：日本島津公司；Milli-Q advantage超純水儀：美國Millipore公司；梅特勒-托利多XS105DU型電子天平：瑞士梅特勒-托利多公司。

1.3 培養(yǎng)基

1）斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基[10]。

2）種子培養(yǎng)基：10°B′e麥芽汁。

3）發(fā)酵培養(yǎng)基：10°B′e 麥芽汁。

1.4 麥芽汁的制作方法

麥芽汁培養(yǎng)基的配制參考《工業(yè)微生物實驗與研究技術(shù)》[11]，進一步優(yōu)化工藝，確定出最佳的工藝參數(shù)：取粉碎后的大麥芽1000 g，加入4000 mL水，在62℃水浴鍋中保溫糖化4 h后，用紗布過濾，除去殘渣，濾液中加入2個雞蛋清，攪拌均勻后煮沸0.5 h，過濾，115℃滅菌15 min即得10°B′e麥芽汁。

1.5 培養(yǎng)方法

將保存的菌種活化后，以體積分數(shù)10%的接種量接入種子培養(yǎng)基中，在30℃條件下，180r/min培養(yǎng)18h，然后按10%的接種量將種子轉(zhuǎn)接到裝有3 L發(fā)酵培養(yǎng)基的7.5 L自動生物發(fā)酵罐中，通氣量1 L/min,溫度30℃，180 r/min培養(yǎng)84 h。

1.6 測定方法

1.6.1 細胞生物量測定

取發(fā)酵液于6000 r/min離心15 min，棄上清液，菌體洗滌3次后，105℃烘干至恒重，稱量。

1.6.2 殘?zhí)橇康臏y定

DNS 法[12]。

1.6.3 GSH產(chǎn)量的測定[13]

發(fā)酵液離心后，洗滌除去上清液，得到濕菌體，加入40%乙醇溶液于30℃振蕩抽提2 h，離心，LLOXAN法測定上清液中GSH產(chǎn)量。

2 結(jié)果與討論

2.1 7.5 L發(fā)酵罐中分批培養(yǎng)

GSH分批發(fā)酵過程曲線如圖1所示。

在GSH生物合成過程中，種子和發(fā)酵培養(yǎng)基選用的都是新鮮麥芽汁，從圖1中可以明顯看出，種子液一經(jīng)接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，菌體就開始迅速生長，直接進入對數(shù)生長期，同時培養(yǎng)基中糖濃度也迅速下降，當發(fā)酵到24h時，糖濃度由初始的42g/L迅速下降到10g/L。另外，在整個發(fā)酵過程中，細胞生長和產(chǎn)物生成完全相耦聯(lián)，當發(fā)酵到48 h時，生物量和GSH產(chǎn)量都達到最大，分別為12.9 g/L、110.5 mg/L。48 h以后，生物量和GSH產(chǎn)量都稍有降低，此時菌體開始自溶，發(fā)酵液中菌體濃度開始下降，同時由于GSH易被氧化分解，所以其濃度也隨之小幅下降[14]。

圖1 GSH分批發(fā)酵過程曲線Fig.1 Process curves of batch fermentation for GSH production

2.2 恒速流加葡萄糖分批培養(yǎng)

在高密度發(fā)酵過程中，流加適量的葡萄糖對于GSH產(chǎn)量的積累非常重要[15-16]。而補糖時間和發(fā)酵液pH值上升時間有關(guān)[17]。發(fā)酵過程中，每隔1 h記錄發(fā)酵液pH，繪制出前10 h pH的變化曲線，如圖2。

圖2 分批培養(yǎng)pH曲線Fig.2 Curve of pH in batch culture

由圖2可見，當發(fā)酵到第7 h時，發(fā)酵液pH值由初始的4.95降到最低，為3.88，7 h以后，pH值開始緩慢上升。根據(jù)上述pH變化情況，本研究從第7h開始恒速流加葡萄糖直至發(fā)酵結(jié)束，流加量為1.5 g/（L·h）。恒速流加葡萄糖分批發(fā)酵過程曲線如圖3所示。

由圖3可見，流加葡萄糖分批發(fā)酵后，生物量的變化趨勢大致和分批發(fā)酵過程相同，都是在48 h時達到最大，流加前后的最大生物量分別為12.9 g/L、13.5 g/L。而GSH產(chǎn)量的變化和流加前不同，經(jīng)流加葡萄糖后，從發(fā)酵開始直至24 h，GSH產(chǎn)量直線上升，24 h時達最大，為151.6 mg/L，與之前分批發(fā)酵的最大值相比，提高了37%。

2.3 半胱氨酸和恒速流加葡萄糖協(xié)同作用分批培養(yǎng)

圖3 恒速流加時GSH分批發(fā)酵過程曲線Fig.3 Process curves of batch fermentation for GSH production under constant speed feeding rate

通常情況下，細胞內(nèi)自身產(chǎn)生的半胱氨酸不能滿足GSH合成的需要，成為GSH合成的限制性因素[18]，Catalino Alfafara等[19]研究了向發(fā)酵罐中一次性添加半胱氨酸和流加2種方法對GSH比合成速率的影響。結(jié)果表明，在6.4 h時，一次性添加3 mmol/L半胱氨酸對GSH的產(chǎn)量有明顯的促進作用。本研究在恒速流加葡萄糖的基礎上，當發(fā)酵至12 h時，向發(fā)酵罐中加入3 mmol/L半胱氨酸，補料分批發(fā)酵過程曲線如圖4所示。

圖4 L-半胱氨酸和恒速流加協(xié)同作用時GSH分批發(fā)酵過程曲線Fig.4 Process curves of batch fermentation for GSH production under L-cysteine and constant speed feeding rate

由圖4可見，當發(fā)酵到24 h時，谷胱甘肽產(chǎn)量達最大，為213.3 mg/L，較只流加葡萄糖提高了41%。生物量的整體變化趨勢和2.1、2.2一致，都是在48 h達最大，但12 h之后，發(fā)酵液生物量總體水平較2.1、2.2有小幅度下降，與Jae-Young Cha等[20]報道的一致?？傊骷影l(fā)酵與添加L-半胱氨酸結(jié)合，較大幅度的提高了目標產(chǎn)物GSH的產(chǎn)量，但是L-半胱氨酸的添加量有待于進一步的優(yōu)化，以此提高GSH產(chǎn)量還有較大的發(fā)展空間。

3 結(jié)論

恒速流加葡萄糖、半胱氨酸和恒速流加葡萄糖協(xié)同作用都提高了目標產(chǎn)物GSH的產(chǎn)量，并且大大縮短了發(fā)酵周期，GSH總產(chǎn)量分別比分批發(fā)酵提高了37%和93%。在高密度培養(yǎng)過程中，由于細胞的快速生長導致發(fā)酵液pH不斷降低，從而大大影響菌體生長及胞內(nèi)GSH的積累。因此，在補料分批發(fā)酵過程中，采用恒pH的分批發(fā)酵來提高GSH的產(chǎn)量將有較大的發(fā)展空間。

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Effects of L-Cysteine and Glucose Fed-Batch Fermentation of Saccharomyces Cerevisiae on Production of Glutathione

ZHENG Li-xue1，2，QI Bin1，2，MEI Yan-zhen1，2，WANG Li-mei1，*
（1.College of Biology and Food Engineering，Changshu Institute of Technology，Changshu 215500，Jiangsu,China；2.Fermentation Engineering Technology Center，Changshu Institute of Technology，Changshu 215500，Jiangsu,China）

The effect of glucose feeding and effects of L-cysteine and glucose synergistic action on the production of glutathione were investigated in 7.5 L fer mentor respectively.When glucose was fed at 7 h under a constant rate of 1.5 g/（L·h）until the end of fermentation,the maximum GSH production reached 151.6 mg/L after 24 h,increased 37%than batch culture.Based on glucose fed-batch,after 12 h and then 3 mmol/L-cysteine was added,the maximum GSH production reached 213.3 mg/L，increased 93%than batch culture.

glutathione；fed-batch culture；glucose fed-batch；L-cysteine

江蘇省高?！扒嗨{工程”中青年學術(shù)帶頭人資助項目；蘇州市科技發(fā)展計劃應用基礎研究項目（YJG0913）；常熟理工學院青年教師科研啟動項目（QZ0914）

鄭麗雪（1982—），女（漢），助理實驗師，碩士，研究方向：食品生物技術(shù)。

*通信作者：王立梅（1964—），女（漢），教授，博士，研究方向：食品生物技術(shù)。

2010-08-16