鄭玲，李麗華，李湧，呂春秋，陳智剛

（廣西出入境檢驗檢疫局技術中心，廣西 南寧 530021）

高效液相色譜法測定飲料中的胭脂樹橙

鄭玲，李麗華，李湧，呂春秋，陳智剛

（廣西出入境檢驗檢疫局技術中心，廣西 南寧 530021）

建立飲料中胭脂樹橙色素的高效液相色譜測定法。飲料樣品經(jīng)過適當?shù)南♂尯?，調(diào)節(jié)pH為8～8.5，直接進樣用HPLC測定樣品中胭脂樹橙色素的含量。色譜柱為ZORBAX Eclipse XDB-C18（5 μm,4.6 mm i.d.×250 mm）,以V（乙腈:VC1%的乙酸溶液）=75:25（體積比）為流動相,紫外檢測器測定；回收率為90.0%～107.4%，相對標準偏差小于2.95%，定量限（S/N≥10）為0.25 mg/kg。

胭脂樹橙；飲料；高效液相色譜

胭脂樹橙色素（annatto extract）是從原產(chǎn)于中南美洲的胭脂樹（Bixa orellana）的種籽假種皮中提取的一種食用天然色素，主要由胭脂樹橙（Bixin）和降胭脂樹橙（Norbixin）組成。根據(jù)提取條件不同分別得到脂溶性胭脂樹橙（用有機溶劑或植物油提取得到）或水溶性的降胭脂樹橙（堿液提?。Ｔ缭谝话俣嗄昵?，胭脂樹橙色素已被美、歐等國作為食品色素使用，廣泛用于甜點、冰淇淋、奶酪等。日本也于1986年將其列為法定的食品色素。我國在2008年6月1日頒布實施的GB2760-2007《食品添加劑使用衛(wèi)生標準》也批準胭脂樹橙色素作為食品添加劑可用于再制干酪、人造黃油、巧克力、糕點、西式火腿、飲料等食品，并制定了相應的允許使用量，但目前國內(nèi)鮮見檢驗食品中胭脂樹橙色素的國家標準及文獻報道，為了維護消費者權益、推動該天然色素的合理使用及控制進口產(chǎn)品質(zhì)量，迫切需要建立食品中胭脂樹橙色素的檢驗方法。目前國外檢測胭脂樹橙色素的方法有分光光度法和高效液相色譜法[1-3]，主要是關于奶酪、黃油、谷物等，檢測飲料中胭脂樹橙的方法少見報道。本文采用直接進樣方法，建立了快速準確測定飲料中胭脂樹橙色素的高效液相色譜法。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

Agilent 1200型高效液相色譜儀（配有紫外檢測器）：美國Agilent公司；Heal Force超純水器：上海Canrex分析儀器公司；PHS-3C型精密pH計：上海雷磁儀器廠；Anke DL-5-B型離心機：上海安亭科學儀器廠。

標準品為Annatto Pigment（粉劑）：購自日本和光純藥工業(yè)株式會社；乙腈（色譜純）：美國Fisher公司；其余試劑均為分析純；飲料樣品均購自南寧市場。

1.2 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18（5 μm,4.6 mm i.d.×250 mm）;流動相:V（乙腈）:V（1%的乙酸溶液）=75:25；流速：1.0 mL/min;柱溫：40 ℃；進樣量：10 μL；檢測波長：460 nm。樣品測定采用色譜峰的保留時間定性，峰面積定量。

1.3 標準溶液的配制及濃度測定

考慮到飲料中使用的色素多為水溶性色素，本實驗僅對飲料中的水溶性胭脂樹橙色素的檢測進行研究，因此，本文所提到的胭脂樹橙色素均指水溶性胭脂樹橙色素（降胭脂樹橙norbixin）。

1.3.1 標準儲備液

準確稱取標準品0.5000 g于小燒杯中，用2.5%的氫氧化鉀溶液溶解，轉移至100 mL容量瓶中，用2.5%的氫氧化鉀溶液定容至刻度，用分光光度法在482 nm下，用1 cm比色皿測定其吸光度，根據(jù)公式（1）計算標準溶液的濃度[1]。

式中：β為胭脂樹橙標準溶液的濃度，（μg/mL）；Aλ為胭脂樹橙標準溶液在482 nm波長時的吸光度。

1.3.2 標準工作液

準確移取一定量的標準儲備液，用1 mol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH為8～8.5，再用pH8～8.5的水定容，配制濃度為10 μg/mL的標準中間液，再從中間液配制一系列的標準工作溶液，使其濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5 μg/mL。

1.4 樣品制備

準確稱取飲料樣品5.00 g于小燒杯中（碳酸飲料需微熱除去二氧化碳），加水至15 mL，用氨水（1+1）調(diào)節(jié)pH為8～8.5，轉移至25 mL容量瓶中，用pH8～8.5的水定容至刻度。過0.45 μm濾膜，待測。

2 結果與討論

2.1 流動相及檢測波長的選擇

分別考察 V（乙腈）:V（水）=75:25、V（乙腈）:V（1%乙酸水溶液）=75:25、V（乙腈）:V（2%乙酸水溶液）=75:25等流動相條件下胭脂樹橙的出峰情況，結果表明，乙腈-水體系下峰形較寬、與雜峰分離度較差且重現(xiàn)性不好，而乙腈-1%乙酸水溶液與乙腈-2%乙酸水溶液出峰情況相當，與文獻[1]報道相符。出于對色譜柱的保護，選用 V（乙腈）:V（1%乙酸水溶液）=75:25作為流動相。

在200 nm到600 nm波長范圍進行掃描，胭脂樹橙在460 nm有最大吸收，在435 nm、488 nm有2個肩峰，因此選擇460 nm作為檢測波長。胭脂樹橙標準譜圖、樣品加標譜圖及光譜圖見圖1～圖3。

2.2 樣品溶液pH范圍的確定

實驗發(fā)現(xiàn)，樣品溶液的pH對檢測結果有較大的影響，在做回收率實驗時，不同樣品及不同加標量的回收率有較大差異，后經(jīng)測定發(fā)現(xiàn),不同樣品溶液的pH有較大差異，高pH時，回收較高，低pH時回收較低，因此，本實驗系統(tǒng)考察了樣品溶液pH對檢測結果的影響，分別調(diào)節(jié)樣品溶液 pH 為 5、6、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10，同時檢測不調(diào)pH的樣品，結果表明：pH小于8時，回收率明顯偏低，當pH大于等于8時，回收率基本穩(wěn)定，因此選擇pH8～8.5為樣品測定的適宜pH范圍。

圖1 胭脂樹橙色素標準物質(zhì)譜圖Fig.1 Chromatograms of norbixin standards

圖2 樣品加標譜圖Fig.2 Chromatograms of a spiked sample

圖3 胭脂樹橙吸收光譜圖Fig.3 Absorption spectra of norbixin

2.3 線性關系及檢出限

分別吸取胭脂樹橙標準系列10 μL在給定條件下進行測定，結果表明：胭脂樹橙在質(zhì)量濃度0.05μg/mL～5 μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關系。峰面積（y）與濃度（x,μg/mL）線性方程為y=131.24x+3.1998、相關系數(shù)為0.9998。

在本實驗條件下，將標準溶液進樣，以10倍信噪比求得胭脂樹橙的定量檢測限為0.25 mg/kg。

2.4 精密度與回收率實驗

在陰性飲料樣品中分別添加2個水平濃度的胭脂樹橙，測定回收率，每個水平均平行處理測定6個樣，計算平均回收率及精密度，結果見表1。

表1 幾種飲料樣品的加標平均回收率及精密度（n=6）Table 1 Recovery rates and relatives standard deviations for norbixin in sevel kinds of beverages(n=6)

2.5 實際樣品的測定

本實驗對市售的果汁飲料、碳酸飲料、果蔬汁飲料、茶飲料進行了檢測，均未檢出胭脂樹橙，說明胭脂樹橙作為一種新批準使用的食用色素，在我國飲料業(yè)尚未推廣使用，但本方法的建立對該色素在我國的合理推廣使用及控制進口產(chǎn)品質(zhì)量具有重要的意義。

本實驗還對乳飲料進行了檢測，加標樣品也無法檢出胭脂樹橙，經(jīng)分析認為是由于使用了蛋白沉淀劑，胭脂樹橙同時也被沉淀，因此，本方法不適用于乳飲料中胭脂樹橙的檢驗。

3 結論

本文采用直接進樣方法，建立了快速準確測定飲料中胭脂樹橙色素的高效液相色譜法。并對果汁飲料、碳酸飲料、果蔬汁飲料、茶飲料進行了加標檢測，結果見表1，加標回收率為90.0%～107.4%，相對標準偏差小于2.95%。方法簡單、快速、準確，可用于飲料中胭脂樹橙色素的檢測。

[1]Kitzelmann E.HPLC and spectrophotometric determination of annato in cheese[J].European Food Research and Technology.A,2002,215(4):359-364

[2]Rios AD.Novel method for the determination of added annatto colour in extruded cornsnack products[J].Food Additives&Contaminants,2004,21(2):125-133

[3]FRANK E.Determination of annatto in high-fat dairy products,margarine and hard candy by solvent extraction followed by high performance liquid chromatography[J].Food Additives&Contaminants,1995,12(1):9-19

Determination of Annatto Extract in Beverage by High Performance Liquid Chromatography

ZHENG Ling,LI Li-Hua,LI Yong,LüChun-qiu,CHEN Zhi-gang
（Guangxi entry－exit Inspection and Quarantine bureau，Nanning 530021,Guangxi,China）

The method for the determination of annatto extract in beverage was studied.After diluted and adjust pH to 8-8.5,the norbixin content was analysed by LC on a column of ZORBAX Eclipse XDB-C18（5 μm,4.6 mm i.d.×250 mm)with V （acetonitrile）:V （1%acetic acid）=75:25 as mobile phase and detected at 460 nm with VWD;limit of quantification（LOQ）was 0.25 mg/kg and the recovery 90.0%-107.4%,the relative standard deviation was less than2.95%.

annat to extract;beverage;high performance liquid chromatography

鄭玲（1972—），女(漢)，工程師，碩士研究生，主要從事食品檢測工作。