吳巍，程秀鳳，王春輝，崔文熹，傅熒熒

（天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司，天津 300457）

以原花青素B2標(biāo)定葡萄籽提取物中原花青素含量

吳巍，程秀鳳，王春輝，崔文熹，傅熒熒

（天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司，天津 300457）

建立以原花青素B2為標(biāo)準(zhǔn)品測定葡萄籽提取物中原花青素含量的方法。以含量≥99%的原花青素B2（HPLC標(biāo)定）做標(biāo)準(zhǔn)品，參照Bate-Smith法，在546 nm處測定吸光度，來標(biāo)定葡萄籽提取物中原花青素含量。原花青素B2通過Bate-Smith法反應(yīng)后的吸光度與濃度成良好線性關(guān)系，其線性范圍為22.89 μg/mL～114.5 μg/mL，r=0.99902（n=5）?；厥章剩?7.99%，RSD:1.02%（n＝6）。該法以通過HPLC標(biāo)定的原花青素單一成分B2做為標(biāo)準(zhǔn)品，解決了過去以原花青素混合物做標(biāo)準(zhǔn)品其原花青素含量標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，無法讓人信服的問題，其測定結(jié)果能準(zhǔn)確反映葡萄籽提取物中的原花青素的真實(shí)含量，可用作質(zhì)控方法。

原花青素B2；原花青素；葡萄籽提取物

原花青素是一類物質(zhì)，它們是由兒茶素、表兒茶素及其沒食子酸酯通過C4-C6或C4-C8鍵共價(jià)相連組成的多聚體，葡萄籽提取物中的最主要成分就是原花青素，各種聚合程度的原花青素在其中混合存在著，測定其中總原花青素的含量是衡量其質(zhì)量好壞的主要指標(biāo)之一。然而目前原花青素的測定存在著一些問題。首先，雖然測定原花青素方法的細(xì)節(jié)各不相同，但基本上都是基于Bate-Smith法，而Bate-Smith法測定的結(jié)果是一個(gè)值，即原花青素值，它是不帶百分號的，而國內(nèi)一些廠商誤把它當(dāng)作百分含量[1]；而另外一些方法[2-3]有了進(jìn)步，引入了原花青素對照樣，然而它們的原花青素對照仍是混合物，如何確定其對照樣的含量仍然是無法讓人信服。為此，采用原花青素B2純品（原花青素二聚體之一，HPLC檢測≥99%）作為對照，測定葡萄籽提取物中的原花青素含量。

1 儀器和試藥

UV-2401紫外可見分光光度計(jì)：島津公司；AS3120超聲波清洗器：天津奧特賽恩斯公司；水浴鍋：天津?qū)嶒?yàn)電爐有限公司；XYE2-10-H超純水機(jī)；市場上按原花青素95%規(guī)格銷售的葡萄籽提取物；原花青素 B2（Proanthocyanidin B2）標(biāo)準(zhǔn)品（≥99%）：天津尖峰公司自制，以日本Asahi Breweries公司產(chǎn)原花青素B2（≥95%）通過HPLC標(biāo)定[4]；鹽酸、正丁醇、硫酸鐵銨、甲醇均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備

精密稱取原花青素B2標(biāo)準(zhǔn)品10 mg于10 mL棕色容量瓶中，加入甲醇適量超聲溶解，放至室溫，加甲醇定容至刻度搖勻，即得。

2.2 樣品溶液制備

精確稱取10 mg樣品至100 mL棕色容量瓶中，加入甲醇適量超聲溶解，放至室溫，加甲醇定容至刻度搖勻。

2.3 測試方法

精密吸取待測溶液1 mL至10 mL棕色容量瓶中，然后加入6.0 mL的5%鹽酸正丁醇溶液（5 mL濃鹽酸，用正丁醇定容至100 mL），0.2 mL的2%硫酸鐵銨溶液（溶解于2 mol/L鹽酸中），混勻，蓋上瓶蓋，用生料帶把瓶口纏嚴(yán)，放于（100±2）℃水浴中，水浴40 min后，取出置冷水?。?℃～10℃）中迅速冷卻20 min，于546 nm處測定吸光度。

2.4 線性關(guān)系考察

分別吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液 0.25、0.5、0.75、1.0、1.25 mL置于10 mL棕色容量瓶中，分別加甲醇定容至刻度搖勻，制成 25、50、75、100、125 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)品溶液，取上述各溶液1 mL，照測試方法（2.3）測定吸光度，以原花青素B2濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y=4976.03X+36.22，R=0.99902；線性范圍為 22.89 μg/mL～114.5 μg/mL。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

分別精密吸取同一樣品溶液各1 mL，照測試方法（2.3）共測定8次，分別讀取吸光度，測得其RSD為0.70%。

2.6 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

取同一批葡萄籽提取物樣品，按上述樣品溶液制備方法制備5份供試液，分別按測試方法（2.3）測定，原花青素平均含量為82.33%，RSD為0.60%，表明本方法重現(xiàn)性較好。

2.7 回收率考察

精密稱取已測知原花青素含量為82.33%的葡萄籽提取物6份，按上述樣品溶液制備方法制備6份供試液，分別精密移取供試液和濃度為0.2456 mg/mL原花青素標(biāo)準(zhǔn)品溶液各0.5 mL于同一10 mL棕色容量瓶中，自“然后加入6.0 mL的5%鹽酸正丁醇溶液”起分別按測試方法（2.3）測定，測得原花青素平均回收率為97.99%，RSD為1.02%。結(jié)果見表1。

表1 原花青素回收率測定結(jié)果Table 1 Results of proanthocyanidins recovery test

2.8 樣品測定

分別取6個(gè)批號的葡萄籽提取物樣品，按上述樣品溶液制備方法制備供試液，分別按測試方法（2.3）測定，用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算含量，測定原花青素含量，結(jié)果見表2。

表2 葡萄籽提取物樣品原花青素含量測定Table 2 Determination of proanthocyanidins in grape seed extracts

3 結(jié)論與討論

1）本試驗(yàn)建立一種以原花青素B2作為對照品，通過Bate-Smith法標(biāo)定葡萄籽提取物中的原花青素，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)>0.999，回收率在95.50%～99.37%之間，精密度在2%以內(nèi)，該測定方法可靠，能準(zhǔn)確反映葡萄籽提取物的質(zhì)量。但由于檢測過程復(fù)雜，因此只有經(jīng)過良好培訓(xùn)的化驗(yàn)員才能準(zhǔn)確檢測。

2）目前市場上能夠買到的原花青素標(biāo)準(zhǔn)品大部分均是原花青素的混合物，而其標(biāo)明的原花青素含量很難讓人信服，而原花青素B2是原花青素的單一成分，本身屬于原花青素二聚體的一種[4]，通過HPLC標(biāo)定其含量，得到的既是原花青素B2的含量，同時(shí)也是其原花青素的含量，這是沒有爭議的。

[1]肖付才，李華，王華.葡萄籽原花青素的提取和檢測方法[J].食品研究與開發(fā)，2007，28(6)：165-169

[2]保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范[S].2003年版.中華人民共和國衛(wèi)生部，2003：274-275

[3]許麗梅，杜永峰，姚秉華.分光光度法測定葡萄籽中原花青素的含量[J].中國藥學(xué)雜志，2005，40(14)：1100-1102

[4]陳召桂，盧艷花，魏東芝.HPLC測定葡萄籽提取物中原花青素B2 的含量[J].中成藥，2007，29(11)：1645-1647

Determine Proanthocyanidins in Grape Seed Extract with Proanthocyanidin B2 Standard

WU Wei，CHENG Xiu-feng，WANG Chun-hui，CUI Wen-xi，F(xiàn)U Ying-ying
（Tianjin Jianfeng Natural product R＆D Co.，Ltd.，Tianjin 300457，China）

To establish a method for detecting proanthocyanidins in grape seed extract with proanthocyanidin B2 standard.Refer to the Bate-Smith method,using proanthocyanidin B2（≥99；HPLC）to calibrate proanthocyanidins in grape seed extract at 546 nm.Linear range of proanthocyanidins is 22.89 μg/mL-114.5 μg/mL（r=0.99902,n=5），Recovery:97.99%,RSD:1.02%（n=6）.Using single ingredient proanthocyanidin B2 standard calibrated by HPLC to calibrate proanthocyanidins,resolving the problem that the standard content is not identical and can not convince when using proanthocyanidin compound standard.The method have better linearity and repeatability,can detect grape seed extract's proanthocyanidins exactly.

proanthocyanidin B2;proanthocyanidin;grape seed extract

吳?。?970—），男（漢），高級工程師，本科，長期從事葡萄籽、蘋果等提取物質(zhì)量檢測工作。

2010-08-30