張桂，趙國(guó)群，姜娟娟

（河北科技大學(xué)，河北 石家莊 050018）

酶法檢測(cè)食品中鎘離子的研究

張桂，趙國(guó)群，姜娟娟

（河北科技大學(xué)，河北 石家莊 050018）

研究利用脲酶比色法檢測(cè)食品中鎘離子的條件與分析步驟，對(duì)松花蛋和番茄醬樣品中的鎘離子進(jìn)行了對(duì)照測(cè)定，與原子吸收測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著性差異（p＝0.95）。回收率為83.2%～99.7%，可靠性良好。

酶法；脲酶；鎘；重金屬

鎘（Cadmium，Cd）在自然界中常與鋅、銅、鉛并存[1]。在食品中，鎘的來(lái)源主要有工業(yè)“三廢”、食品添加劑和原材料、食品容器具、礦物復(fù)合肥等。

食品中鎘的含量直接關(guān)系到食品安全[2]。利用脲酶活性對(duì)重金屬有高度的敏感性[3]，探尋用脲酶活性的測(cè)定來(lái)評(píng)價(jià)食品樣品中重金屬含量的方法，研究食品中的鎘對(duì)脲酶活性影響的規(guī)律及準(zhǔn)確測(cè)定的條件，此方法不需要價(jià)格昂貴的大型儀器，適用于中小型食品企業(yè)進(jìn)行食品中鎘含量的測(cè)定。

1 技術(shù)方案

根據(jù)已經(jīng)掌握的資料，確定基本試驗(yàn)方案見(jiàn)圖1。所有試驗(yàn)用試管均需在硝酸與水體積比為1:5的硝酸溶液中浸泡過(guò)夜，然后用水反復(fù)沖洗，最后用去離子水沖洗干凈。

圖1 分析步驟圖Fig.1 Flow chart of analysis

2 實(shí)驗(yàn)原理

脲酶水解尿素產(chǎn)生2分子氨和1分子二氧化碳，氨在堿性介質(zhì)中與苯酚及次氯酸鈉反應(yīng)，生成藍(lán)色的靛酚，在671 nm處有吸收峰。將一定濃度的鎘離子溶液加入到尿素底物溶液中時(shí)，鎘離子會(huì)抑制脲酶的活性，其催化尿素分解生成靛酚的吸光度值的變化可以間接反映鎘的含量。

3 材料與設(shè)備

3.1 原料與主要試劑

松花蛋、馬口鐵罐裝番茄醬。硝酸、過(guò)氧化氫、鎘粒、尿素、氫氧化鈉、苯酚、脲酶等，化學(xué)試劑均為分析純。

3.2 儀器與設(shè)備

AAS-100型原子吸收分光光度計(jì)、HGA-800型石墨爐：美國(guó)PE公司；LTG-20鋼襯F4高壓消解罐：上海隆拓廠；鎘空心陰極燈：美國(guó)加聯(lián)儀器有限公司；TU-1810型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

3.3 主要試劑配制方法

1）酚顯色劑：苯酚5.00 g，亞硝基鐵氰化鈉（含2分子結(jié)晶水）0.025 g，溶于500 mL去離子水中，常溫下保存。

2）堿性次氯酸鈉溶液：氫氧化鈉2.50 g溶于去離子水中，加安替福明4 mL，稀釋至500 mL，置棕色瓶?jī)?nèi)，常溫下避光保存。

3）脲酶溶液：精確稱(chēng)取脲酶2.5 mg，加三蒸水至25 mL，置于冰箱保鮮室內(nèi)可以保存約1周，呈現(xiàn)渾濁時(shí)不得使用。

4）尿素溶液（3%）：精確稱(chēng)取尿素 3.00 g，溶解于去離子水，定容至100 mL，置于冰箱保鮮室內(nèi)保存。

5）鎘標(biāo)準(zhǔn)貯備液：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5000 g金屬鎘粒，加20 mL鹽酸和2滴硝酸溶解，移入500 mL容量瓶中，加水至刻度?；靹蚝?，此溶液每毫升含1.0 mg鎘，用時(shí)再用去離子水稀釋至相應(yīng)濃度。

6）鎘標(biāo)準(zhǔn)使用液：精確量取6 mL鎘標(biāo)準(zhǔn)貯備液，用去離子水稀釋至50 mL，室溫下備用。

4 脲酶法檢測(cè)食品中鎘的條件探索

4.1 抑制率的計(jì)算

按照?qǐng)D1試驗(yàn)步驟，每次試驗(yàn)過(guò)程中設(shè)置4支試管，1支作為對(duì)照管，3支作為樣品管。使用分光光度計(jì)測(cè)定純凈的鉛、鎘溶液對(duì)脲酶活性呈現(xiàn)抑制的效果。用“抑制率”作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。計(jì)算公式為：

式中：μ為重金屬對(duì)脲酶的抑制率，%；A1為對(duì)照管吸光度值；A2為3支樣品管吸光度均值。

4.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

為了考察各種因素，不同水平的綜合效應(yīng)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以脲酶含量，反應(yīng)溫度，反應(yīng)時(shí)間，顯色時(shí)間4個(gè)參考因素4個(gè)水平，以鎘對(duì)脲酶活性抑制率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行L16（45）正交試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 鎘抑制率正交試驗(yàn)因素水平表L16(45)Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment of cadmium inhibition rate L16(45)

4.3 不同因素水平對(duì)鎘的抑制率的影響

鎘抑制率正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 鎘抑制率正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test of cadmium inhibition rate

對(duì)鎘抑制率而言，各因素作用的主次順序如下：反應(yīng)時(shí)間＞反應(yīng)溫度＞脲酶用量＞顯色時(shí)間。并得出各因素的較好水平組合為A1B3C2D3，即脲酶用量0.5 mL、反應(yīng)溫度50℃、反應(yīng)時(shí)間30 min、顯色時(shí)間30 min。

由于正交試驗(yàn)得出的各因素水平最佳組合在正交試驗(yàn)中并沒(méi)有出現(xiàn)，因此必須使用最佳組合的各因素水平進(jìn)行試驗(yàn)，與正交試驗(yàn)中抑制率最高的組合進(jìn)行比較，驗(yàn)證得出該因素水平組合是否為最優(yōu)組合，此即驗(yàn)證性試驗(yàn)。通過(guò)驗(yàn)證性試驗(yàn)，得出較好水平A1B3C2D3組合的抑制率為85.53%，比正交試驗(yàn)中抑制率最高的2號(hào)試驗(yàn)組合，即A1B3C3D3組合的抑制率83.58%高。因此確定最佳的試驗(yàn)條件為A1B3C2D3，即：脲酶用量0.5 mL、反應(yīng)溫度50℃、反應(yīng)時(shí)間30 min、顯色時(shí)間30 min。

4.4 測(cè)定鎘含量時(shí)掩蔽劑的選擇

經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)證明復(fù)合掩蔽劑250 g/L檸檬酸鈉:400 g/L 酒石酸鉀鈉:200 g/L 氫氧化鈉=3:4:1，掩蔽其它離子效果最好。

4.5 鎘離子對(duì)脲酶作用效果標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

鎘離子對(duì)脲酶作用效果標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖2。

圖2 吸光度與鎘溶液濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Relationship between absorbency and cadmium ions solution concentrations

5 脲酶法測(cè)定食品樣品中鎘含量的結(jié)果比較

嚴(yán)格遵照所探索的最佳條件，按照實(shí)驗(yàn)步驟圖1所示，在正交試驗(yàn)確定的最佳的條件下，在加入1 mL食品樣品預(yù)處理液之后，加入相應(yīng)體積的掩蔽劑，完成反應(yīng)后測(cè)定體系的吸光度值，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算出樣品中的鎘含量。將測(cè)定結(jié)果與原子吸收法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，考察差異的顯著性結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 食品樣品中鎘含量測(cè)定的結(jié)果Table 3 Results of cadmium ions concentrations in food samples

t0.05（2）=4.3027，表3中t值絕對(duì)值均小于此值，說(shuō)明p=0.95，差異不顯著，可認(rèn)為脲酶法的檢測(cè)結(jié)果與石墨爐法的檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有明顯差異，因而認(rèn)為脲酶法的檢測(cè)結(jié)果是值得信任的。

6 脲酶法測(cè)定食品中鎘的回收率

量取番茄醬和松花蛋預(yù)處理液5 mL，分別加入10 μg/mL 和 30 μg/mL 的鎘離子溶液 5 mL，混勻，按照試驗(yàn)流程，用脲酶法進(jìn)行檢測(cè)3次，結(jié)果見(jiàn)表4。考慮到溶液體積變化，計(jì)算回收率為83.2%～99.7%。

表4 食品樣品中鎘離子回收率實(shí)驗(yàn)的結(jié)果Table 4 Experimental recovery of cadmium ions in food samples

7 結(jié)論

1）研究證明脲酶檢測(cè)法確實(shí)可以用于食品中鎘含量的測(cè)定。脲酶的抑制率與鎘的含量呈線性正相關(guān)，最小檢測(cè)量能夠滿(mǎn)足國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的限量檢測(cè)，為進(jìn)一步研究快速檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。

2）確定了食品中鎘離子檢測(cè)的最佳條件為：即脲酶用量0.5 mL、反應(yīng)溫度50℃、反應(yīng)時(shí)間30 min、顯色時(shí)間30 min。鎘離子溶液對(duì)脲酶活性的抑制率最高可以達(dá)到85.53%。

3）找到了適宜食品中鎘離子檢測(cè)使用聯(lián)合掩蔽劑。

4）分別用酶法與原子吸收法檢測(cè)番茄醬和松花蛋預(yù)處理液中的鎘元素，檢測(cè)結(jié)果兩者無(wú)顯著性差異（p=0.95）?；厥章蕿?3.2%～99.7%，可靠性良好。

[1]Landi L,Renella G,Morexo J L,et al.Influence of Cd on the Metabolic Quotient,L-：D-glutamic acid respiration ratio and enzyme activity:microbial biomass ratio under laboratory conditions[J].Biology and Fertility of Soils，2000,32：8-16

[2]劉寧,沈明浩.食品毒理學(xué)[M].北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社,2005：279-280

[3]Tadeusz K,Malgorzata M,Trojanowicz M.Inhibitive determination of mercury and other metal ions by potentiometric urea biosensor[J].Biosensors&bioelectronics，2000，15：681-691

Study on Determination of Cadmium Ions in Food by Using Enzyme

ZHANG Gui，ZHAO Guo-qun，JIANG Juan-juan
（Hebei University of Science ＆ Technology，Shijiazhuang 050018，Hebei，China）

Study on the condition and approach by used urease to detect Cd ions in food,detect cadmium ions concentration in preserved egg and tomato sauce,which had yielded highly desirable results.Compared with the results of atomic absorption spectrometry,there was no significant difference（p＝0.95）.The recovery rate was between 83.2%and 99.7%,which was much reliable.

enzyme method;uerase;cadmium;heavy metals

張桂（1951—），女（漢），教授，本科，研究方向：食品加工與保鮮。

2010-08-15