康慶華 ，徐 涵 ，關(guān)鳳芝 ，吳廣文 ，孫中義 ，黃文功 ，程莉莉 ，姜衛(wèi)東 ，趙東升 ，劉 巖 ，吳建忠 ，宋喜霞 ，余 瑩

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所哈爾濱150086；2.法國圖盧茲綜合科學(xué)研究所（IRIT-ARI）法國，圖盧茲31300；3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所哈爾濱150086）

栽培種亞麻（Linum usitatissimum L.），簡稱亞麻，屬亞麻科、亞麻屬（Linum）[1]，該種內(nèi)極少部分種質(zhì)存在多胚性，即在一個(gè)胚珠內(nèi)存在兩個(gè)或兩個(gè)以上胚胎。在多胚中，附加胚大多由植物無融合生殖產(chǎn)生，從多胚苗中可能篩選獲得單倍體，所以多胚亞麻的利用成為當(dāng)今亞麻育種的一個(gè)新方向。多胚亞麻的胚胎學(xué)研究是多胚種質(zhì)利用的基礎(chǔ)，但至今其細(xì)胞學(xué)機(jī)制未能明確。因此進(jìn)行亞麻多胚胚胎發(fā)生及發(fā)生方式的研究是十分必要的。

植物幼胚被多層胚珠組織包裹，通常采用切片、人工分離(酶法或手工分離)、整體-透明等方法觀察。其中整體透明技術(shù)是觀察植物幼胚最快捷、最簡單的方法。植物胚珠的整體透明技術(shù)最初由Herr(1971)提出，但Herr的方法需要使用相差和干涉顯微鏡[2]。在此基礎(chǔ)上，Crane(1978)使用冬青油(水楊酸甲酯，methyl salicylate)作為透明劑對整體透明技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)，用于觀察整體胚珠中的胚囊，效果良好[3]。后來，楊弘遠(yuǎn)使用愛氏蘇木精(Ehrlich’s hematoxylin)染色-冬青油透明技術(shù)進(jìn)一步完善了整體染色與透明技術(shù)[4][5][6]，但該技術(shù)制片時(shí)間長（至少需要2 d）而且所使用的透明劑冬青油具有毒性[7]。由于本試驗(yàn)所要進(jìn)行的是在大量胚珠篩選多胚并對雙胚的發(fā)生及發(fā)生方式進(jìn)行觀察，需要達(dá)到量化的、3D數(shù)據(jù)采集目的，所以進(jìn)行了改進(jìn)，獲得了快速、低毒、易于解剖和觀察的較好效果。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用的亞麻幼嫩果序于2010年7月上旬采自黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所哈爾濱市試驗(yàn)區(qū)。該試驗(yàn)材料組合號H04052，為多胚誘導(dǎo)雜交組合的后代。采集后直接用于試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

固定：果序取回后，在卡諾固定液常溫固定24小時(shí)后放于75%的酒精中保存。

水合：用50%、25%、0%的酒精溶液沖洗。

解離：從果序上摘下蒴果，分三類：受精1～3d的為一類，放入同一三角瓶內(nèi)，受精4～6d的為一類，受精7d以上的為一類。加入1M氫氧化鈉溶液60°C下處理10～30min。冷卻后用清水沖洗。

透明：剖開蒴果取出受精后的胚珠放入10%次氯酸鈉溶液中浸透（真空）2h。

解剖觀察：取已透明的胚珠用水沖洗后，放在培養(yǎng)皿或載玻片上，在Leica倒置熒光顯微鏡下觀察、解剖并顯微攝像。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞麻的子房結(jié)構(gòu)觀察

將亞麻受精后的子房剖開后，可見5個(gè)子房室(幼嫩果室)，每個(gè)子房室內(nèi)有2個(gè)胚珠。一般1個(gè)胚珠發(fā)育成1個(gè)正常的幼嫩種子。

2.2 亞麻受精胚珠的透明效果

已透明的胚珠用清水沖洗后，胚珠內(nèi)的幼胚輪廓已明顯可見(圖1～3)。

2.3 胚珠內(nèi)幼胚的觀察與解剖

壓片后在顯微鏡下可觀察到的幼胚。受精4～6d的胚珠透明效果最好，容易完整解剖出幼胚(圖4～6)。

2.4 多胚發(fā)生率

整體解剖50個(gè)胚珠，其中有20個(gè)沒有胚胎（原因可能是授粉不良所致）；26個(gè)具有正常的單個(gè)合子胚；4個(gè)具有雙胚。雙胚發(fā)生率為8%。

2.5 多胚排列方式

所觀察到的4個(gè)多胚胚珠都是雙胚（圖7～9），胚胎在胚乳中生長。其中，有1個(gè)著生位置不能確定，1對雙胚疑似2個(gè)胚縱向羅列，另外兩個(gè)胚珠的雙胚都是縱向羅列。這些雙胚都是小的胚靠近珠孔端生長，而較大的胚在合點(diǎn)端生長。

圖1 ～3.已透明的部分胚珠 圖4～6.剝離出的亞麻幼胚 圖7～9.剝離出的多胚亞麻雙胚顯微鏡下觀察到的多胚性亞麻種質(zhì)的幼胚Fig.1 ～3 Parts of cleared flax ovules Fig.4～6 Isolated young embryos Fig.7～9 Isolted twin embryos of polyembryonic flax and young embryos observed under binocular microscopy

3 問題與討論

利用該技術(shù)對多胚受精后的胚珠進(jìn)行整體透明并解剖，方法簡單，可節(jié)省染色和透明時(shí)間，并且能取得較好的觀察和采集3D數(shù)據(jù)的效果。通常，10%的次氯酸鈉溶液應(yīng)用為漂洗液或消毒液，本試驗(yàn)做為透明劑使用，與冬青油、丁香油、油鏡油等透明劑相比具有價(jià)格便宜、容易購買等優(yōu)點(diǎn)，并具有良好改變材料的透光性能。

在本試驗(yàn)中，利用10%的次氯酸鈉溶液透明時(shí)，應(yīng)將浸透種子的容器抽成真空，才能完全除去胚珠內(nèi)的氣泡，否則胚珠內(nèi)層的氣泡將使透明劑無法快速對胚珠進(jìn)行浸潤、透明，在顯微鏡下出現(xiàn)不透明的黑色斑點(diǎn)，不能獲得較好的透明和觀察效果。本試驗(yàn)利用該技術(shù)雖然對觀察和解剖多胚亞麻的胚珠取得了較好的效果，但也存在一定的缺點(diǎn)：當(dāng)對試驗(yàn)中所剝離到的雙胚進(jìn)行DAPI以觀察染色體時(shí)，沒有獲得理想的染色效果。原因可能是DNA被強(qiáng)堿等水解。

多胚亞麻的幼胚顯微鏡下觀察的結(jié)果表明，受精7d以內(nèi)的胚珠透明效果較好，受精8d以上的胚珠應(yīng)增加堿解時(shí)間和透明時(shí)間；受精1～3d的胚珠很難剝離到幼胚；受精4～6天的胚珠是觀察和剝離幼胚最佳時(shí)期。

在以往的多胚材料發(fā)芽試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)雙胚種子的兩條胚根可以從種子的不同部位發(fā)生，認(rèn)為雙胚在胚珠中可能存在多種排列方式。但本試驗(yàn)在同一胚囊內(nèi)所觀察和解剖到的雙胚都呈縱向羅列方式，小胚靠近珠孔端生長，較大的胚在合點(diǎn)端生長。至于是否存在橫向或縱向并列等方式排列有待進(jìn)一步探討。本試驗(yàn)未觀察到三胚、四胚胚珠。

[1]王玉富，粟建光，等.亞麻種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2006.

[2]J.M.Herr,Jr.,A New Clearing-Squash Technique for the Study of Ovule Development in Angiosperms[J].American Journal of Botany,1971,58(8):785-790.

[3]Crane.C.F.,Apomixis and crossing incompatibilities in some Zephyrantheae.Ph.D.Thesis,University of Texas,Austin,TX,1978.

[4]楊弘遠(yuǎn).用整體染色與透明技術(shù)觀察胚囊、胚、胚乳和胚狀體[J].植物學(xué)報(bào),1986,28(6):572-581.

[5]楊弘遠(yuǎn).植物胚胎學(xué)中的整體透明技術(shù)[J].植物學(xué)報(bào),1988,30(2):114-116.

[6]楊弘遠(yuǎn),周嫦.植物有性生殖實(shí)驗(yàn)研究四十年[M].武漢:武漢大學(xué)出版社,2001.

[7]李正理.植物制片技術(shù)[M]..北京:科學(xué)出版社,1987.