李 萍，田 方，宋 琦，劉煥霞，李孟芳，魏 丹

（遵義醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院 病例科，貴州遵義563000）

Zuk等[1]于2001年首次從人抽取脂肪中分離出一種具有成纖維樣形態(tài)的細(xì)胞亞群，并命名為提取的抽脂物細(xì)胞(processed lipoaspirate,PLA)，經(jīng)特異因子誘導(dǎo)可向骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞和軟骨細(xì)胞等多譜系細(xì)胞分化，次年，又從PLA細(xì)胞亞群中分離出形態(tài)均一、經(jīng)分子生物學(xué)和生物化學(xué)檢測(cè)可多系分化的細(xì)胞克隆，稱之為脂肪來源干細(xì)胞(Adipose-derived stem cells ，ADSCs)[2]。ADSCs因其對(duì)組織損傷小、具有多系分化潛能，且來源廣泛、獲得率高、沒有倫理道德問題等優(yōu)點(diǎn)，有望替代骨髓組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成為自體成體干細(xì)胞來源，應(yīng)用于臨床移植治療。

脂肪來源細(xì)胞培養(yǎng)普遍使用含血清的培養(yǎng)基，尤其是胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)。我們采用新生牛血清替代傳統(tǒng)的胎牛血清培養(yǎng)分離的大鼠脂肪來源細(xì)胞，觀察新生牛血清對(duì)大鼠脂肪來源細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，以期用價(jià)格較便宜的新生牛血清替代傳統(tǒng)價(jià)格較貴的胎牛血清進(jìn)行脂肪來源細(xì)胞培養(yǎng)。

1 材料和方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 出生后3~5d的SD大鼠（我校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）；Ⅰ型膠原酶（Sigma,美國(guó)）；DMEM/F12(1:1)培養(yǎng)基（Gibco,美國(guó)）；新生牛血清（杭州四季青）；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；倒置相差顯微鏡（Olympus,日本）；CO2孵箱（Thermo,美國(guó)）。

1.2 大鼠脂肪來源細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

1.2.1 切取大鼠腹溝股脂肪組織 取出生后4d的SD乳鼠4只，引頸處死、消毒，切腹股溝脂肪組織，剔除結(jié)締組織及肉眼可見的小血管，含1%抗生素的PBS沖洗3次。具體方法詳見參考文獻(xiàn)[3]。

2.2.2 細(xì)胞懸液的制備 眼科剪將脂肪組織塊剪成漿糊狀；移至青霉素小瓶中，加入1~2 mL0.1%Ⅰ型膠原酶溶液，37℃水浴箱孵育40~60min；消化液吹、過濾，收集濾液。

2.2.3 大鼠脂肪來源細(xì)胞的培養(yǎng) 將上述單細(xì)胞懸液離心，棄去上層脂肪和上清，清洗2~3次；加入2mL基礎(chǔ)培養(yǎng)液（D/F12+10%新生牛血清+1%青霉素鏈霉素）重懸細(xì)胞以1×106接種于培養(yǎng)瓶，CO2孵箱培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底面積的80%，標(biāo)準(zhǔn)的胰酶消化法1:3傳代細(xì)胞。倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果

新生牛血清培養(yǎng)的P0代脂肪來源細(xì)胞的形態(tài):原代脂肪來源細(xì)胞在24h后大部分都會(huì)貼壁,在倒置相差顯微鏡下細(xì)胞呈集落樣生長(zhǎng)，似魚群狀或漩渦狀，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，集落逐漸增大、相互融合直至細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底；大部分細(xì)胞呈現(xiàn)成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，短梭形或多角形，細(xì)胞形態(tài)較均一。（圖1）。

圖1 P0代脂肪來源細(xì)胞魚群狀的細(xì)胞集落（×100）

在P2~P3代細(xì)胞分支增多，胞體增大，細(xì)胞的形態(tài)趨向多樣，細(xì)胞胞漿內(nèi)特別是在核區(qū)附近出現(xiàn)黑色顆粒，提示細(xì)胞開始出現(xiàn)老化（圖2、3）。

圖2 新生牛血清培養(yǎng)的P3代老化細(xì)胞（×100）

圖3 新生牛血清培養(yǎng)的P3代老化細(xì)胞（×200）

3 討論

體外培養(yǎng)的細(xì)胞受到外界環(huán)境影響的因素很多，細(xì)胞狀態(tài)的改變也與多方面因素有關(guān)。細(xì)胞老化的原因很復(fù)雜。在培養(yǎng)過程中，不僅是培養(yǎng)液、血清、消化液因素，還有溫度，光照，含氧量等因素都可能。細(xì)胞在培養(yǎng)過程中如果環(huán)境不適合其生長(zhǎng)就會(huì)出現(xiàn)部分細(xì)胞的老化現(xiàn)象，表現(xiàn)為：①細(xì)胞胞漿內(nèi)特別是在核區(qū)附近出現(xiàn)黑色顆粒；②細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)空泡；③細(xì)胞立體感逐漸消失，細(xì)胞間的間隔不清，部分細(xì)胞扁平狀，細(xì)胞的形態(tài)趨向多樣；④貼壁性減退，出現(xiàn)一些漂浮的細(xì)胞；⑤部分分泌強(qiáng)的細(xì)胞分泌物增多，細(xì)胞表面會(huì)比較臟；⑥細(xì)胞增殖速度明顯下降，分裂相的細(xì)胞明顯減少等。

有研究認(rèn)為，血清質(zhì)量的好壞最直接影響到胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells,ES）的培養(yǎng)，使用優(yōu)質(zhì)血清ES細(xì)胞的克隆率能達(dá)20%以上[4]。在胎兒、兒童和成人組織中存在的成體干細(xì)胞（adult stem cells）是由ES細(xì)胞繼續(xù)分化形成的多能干細(xì)胞。脂肪來源干細(xì)胞是多能干細(xì)胞。因此，血清質(zhì)量的好壞可影響體外培養(yǎng)的脂肪來源干細(xì)胞。牛血清作為細(xì)胞培養(yǎng)中用量最大的天然培養(yǎng)基，其中含有豐富的細(xì)胞生長(zhǎng)必須的營(yíng)養(yǎng)成份。胎牛血清取自剖腹產(chǎn)的胎牛；新牛血清取自出生24h內(nèi)的新生牛。

據(jù)實(shí)驗(yàn)[5]，使用DMEM培養(yǎng)基并添加5%胎牛血清的培養(yǎng)條件下，P2代~P3代時(shí)增殖迅速、形態(tài)均勻、大部分呈長(zhǎng)梭形、排列規(guī)則，P5代后脂肪干細(xì)胞仍可以保持較強(qiáng)的增殖能力，并保持其表型和更強(qiáng)的多向分化潛能。本實(shí)驗(yàn)中，我們使用了新生牛血清代替?zhèn)鹘y(tǒng)培養(yǎng)脂肪來源細(xì)胞使用的胎牛血清，脂肪來源細(xì)胞在P0代生長(zhǎng)較好：細(xì)胞形態(tài)大致均一、呈放射狀排列的團(tuán)樣細(xì)胞集落，伸出長(zhǎng)短不一、粗細(xì)不均的突起、胞核大、核仁清晰、有較多分裂相；但P2代~P3代即出現(xiàn)了老化現(xiàn)象。該現(xiàn)象提示，脂肪來源細(xì)胞的體外培養(yǎng)中，優(yōu)質(zhì)的胎牛血清可能優(yōu)于新生牛血清?？赡芘c胎牛尚未與外界環(huán)境接觸，其血清中所含的抗體、補(bǔ)體等對(duì)細(xì)胞有害的成分較少有關(guān)。王?？频萚6]發(fā)現(xiàn)：新生牛血清培養(yǎng)的脂肪來源細(xì)胞較純，而胎牛血清更適于血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)。但我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，盡管采用新生牛血清可以得到形態(tài)較為均一的原代脂肪來源細(xì)胞，但細(xì)胞在較早期即出現(xiàn)了老化現(xiàn)象。因此，我們推測(cè)，新生牛血清對(duì)脂肪來源細(xì)胞的活力有負(fù)面影響，可能不適用于脂肪來源細(xì)胞的培養(yǎng)。

[1]Zuk P A,,Min Zhu,Ashjian Peter,et al.Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells[J].Molecular Biology of the Cell,2002,13:(12)4279-4295.

[2] Zuk P A.,Min Zhu,Mizuno H,et al.Multilineage cells from human aipose tissue:implications for cell-based therapies[J].Tissue Engineering,2001,7(2):211-228.

[3] 陳小紅,劉魯川,金巖,等.脂肪來源干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成牙本質(zhì)樣細(xì)胞的體外培養(yǎng)研究[J].實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志,2008,24(1):9-12.

[4] Boquest AC,Shahdadfar A,Brinchmann JE.Isolation of stromal stem cells from human adipose tissue[J].Methods Mol Biol,2006,325:35-46.

[5] 趙彩霞.脂肪干細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的初步研究[D]，碩士學(xué)位論文，2009.1-42.

[6] 王福科,趙德萍,代曉明,等.不同類型血清對(duì)大鼠脂肪干細(xì)胞分離培養(yǎng)的影響[J].昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2010(3):4-10.