孔祥勇，劉煜宇，鄭琳，鄒由，李學(xué)杉

（云南瑞升煙草技術(shù)（集團(tuán)）有限公司，云南 昆明 650106）

羅漢果 [Siraitia grosvenorii（Swingle）C.Jeffrey]為葫蘆科（cucurbitaceae）羅漢果屬植物，其果實(shí)又名拉漢果、紅毛果、羅幌子、假苦瓜等，是我國(guó)特有藥用植物，為衛(wèi)生部首批公布的藥食兩用名貴中藥材，為傳統(tǒng)中藥和出口商品之一，是我國(guó)特有的珍貴葫蘆科植物，素有良藥佳果之稱。含大量葡萄糖和一種比砂糖甜300倍的羅漢果甙（三萜甙類），還含有D-甘露醇有清肺止咳作用[1-3]。主要產(chǎn)于廣西省桂林市臨桂縣和永福縣的山區(qū)，是桂林名貴的土特產(chǎn)。目前的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)均主要是對(duì)其常規(guī)化學(xué)成分及提取的研究[4-7]，但鮮見(jiàn)采用超臨界CO2萃取優(yōu)化工藝，并分析其化學(xué)成分的報(bào)道。

超臨界流體萃取技術(shù)（Supercritical fluid extraction，SFE）是近20多年發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新型分離精制技術(shù)，工藝簡(jiǎn)單，操作方便。超臨界CO2萃取在萃取植物有效成分時(shí)克服了溶劑提取法在分離過(guò)程中需蒸餾加熱，易氧化、酸敗等缺點(diǎn)，同時(shí)，具有萃取時(shí)間短，對(duì)萃取物選擇性高，無(wú)溶劑殘留等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的提取中，特別適合于食品工業(yè)生物活性物質(zhì)和熱敏性物質(zhì)的分離提取。

本文以羅漢果提取率為考察指標(biāo)，采用超臨界CO2萃取法，通過(guò)正交設(shè)計(jì)優(yōu)化[8-11]確定了羅漢果有效成分的最佳提取條件，可為羅漢果的綜合開(kāi)發(fā)發(fā)展提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料

羅漢果（市售）,過(guò)20目篩的粗粉。

1.1.2 儀器

HA211-50-06超臨界流體萃取裝置：江蘇省南通市海安超臨界萃取有限公司；Agilent 6890N／5975氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)安捷倫公司；HXC576血液冷藏箱：青島海爾特種電器有限公司；電子天平：上海梅特勒－托利多儀器有限公司；粉碎機(jī)：NK－505，中山市龍的電器實(shí)業(yè)有限公司；BUCHIR－3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士BUCHI公司；SHZ－D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.1.3 試劑

CO2（純度99.5%）：昆明梅塞爾公司；φ（乙醇）=95%（食品級(jí)）；無(wú)水硫酸鈉（AR）：廣東汕頭市西隴化工廠；二氯甲烷（AR）：天津市博迪化工有限公司。

1.2 方法

1.2.1 超臨界CO2萃取工藝

稱取羅漢果粉末500 g并將其置于萃取釜中，夾帶溶劑為100 g φ（乙醇）=95%，設(shè)定萃取溫度，溫度穩(wěn)定后通入CO2氣體，分別試驗(yàn)萃取壓力、萃取溫度、CO2流量和萃取時(shí)間對(duì)羅漢果萃取物得率的影響。萃取結(jié)束后收集分離釜中的萃取物，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸餾，濃縮物即為羅漢果萃取物。

計(jì)算公式：萃取得率/%=羅漢果萃取物質(zhì)量（g）/羅漢果粉末原料質(zhì)量（g）×100。

1.2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

超臨界CO2萃取羅漢果時(shí)，既要考慮產(chǎn)品的得率，又要考慮萃取速率和成本等因素，因此需要考察的工藝參數(shù)有萃取壓力、萃取溫度、萃取時(shí)間、CO2流量和原料粒徑等。根據(jù)有關(guān)資料和預(yù)備單因素試驗(yàn)，試驗(yàn)選擇萃取壓力、萃取溫度、CO2流量和萃取時(shí)間作為主要影響因素，以測(cè)得羅漢果樣品得率為考察指標(biāo)，進(jìn)行L9（34）四因素三水平正交試驗(yàn)，確定了對(duì)提取率影響最顯著的水平見(jiàn)表1，每次試驗(yàn)重復(fù)2次。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表L9（34）Table 1 Factors and levels of L9（34）orthogonal experiment

1.2.3 GC/MS分析條件

前處理：稱取1.00 g樣品，以10 mL二氯甲烷溶解，加入適量無(wú)水硫酸鈉置于4℃冰箱脫水12 h后過(guò)濾，濾液使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行檢測(cè)。

儀器檢測(cè)：毛細(xì)管柱：HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25μm）；進(jìn)樣口溫度：240℃；載氣：He，恒壓模式70kPa；程序升溫：50℃（1 min）—8℃/min—160℃（2 min）—8 ℃/min—260 ℃（15 min）；進(jìn)樣量：0.5μL；分流比：25∶1；傳輸線溫度：280 ℃；電離方式：EI；電離能量：70 eV；離子源溫度：230℃；四級(jí)桿溫度：160℃；質(zhì)量范圍35 aum～455 aum。溶劑延遲：2 min。

檢測(cè)模式：SCAN和SIM同步。

譜圖檢索：所得圖譜經(jīng)計(jì)算機(jī)譜庫(kù)（NIST05,Wiley275）檢索，并結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖和有關(guān)文獻(xiàn)[12]，確定揮發(fā)性成分。并用色譜峰面積歸一化法測(cè)定得各揮發(fā)性成分的峰面積。

2 結(jié)果與討論

2.1 正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2～表7。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment

表3 L9（34）正交試驗(yàn)方差分析Table 3 Variance analysis of L9（34）orthogonal experiment

表4 因素A多重比較表（LSD法）Table 4 Multiple Comparisons（LSD）of Factor A

表5 因素B多重比較表（LSD法）Table 5 Multiple Comparisons（LSD）of Factor B

表6 因素C多重比較表（LSD法）Table 6 Multiple Comparisons（LSD）of Factor C

表7 因素D多重比較表（LSD法）Table 7 Multiple Comparisons（LSD）of Factor D

2.1.1 正交試驗(yàn)結(jié)果的直觀分析

根據(jù)極差R的大小，可以看出各因素對(duì)羅漢果萃取物得率的影響程度依次為：A（萃取壓力）>C（CO2流量）>D（萃取時(shí)間）>B（萃取溫度）。

根據(jù)平均萃取率k的大小，可以看出萃取壓力A3時(shí)，萃取率最高。萃取溫度B2時(shí)，萃取率最高。CO2流量C2時(shí)，萃取率最高。萃取時(shí)間D2時(shí)，萃取率最高。因此，可以確定最佳萃取條件為A3B2C2D2，即萃取壓力30 MPa，萃取溫度45℃，CO2流量25kg/h，萃取時(shí)間3.0h。

2.1.2 正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析和多重比較

方差分析結(jié)果表明，各因素對(duì)羅漢果萃取物得率的影響程度為：A（萃取壓力）、B（萃取溫度）、C（CO2流量）、D（萃取時(shí)間）影響都達(dá)到了極顯著程度（P<0.01）。

多重比較結(jié)果表明，A（萃取壓力）各水平之間差異極顯著（P<0.01）。B（萃取溫度）1和3水平之間差異不顯著（P>0.05），其余水平之間差異極顯著（P<0.01）。C（CO2流量）各水平之間差異極顯著（P<0.01）。D（萃取時(shí)間）1和3水平之間差異不顯著（P>0.05），其余水平之間差異極顯著（P<0.01）。因此，可以確定最佳萃取條件為A3B2C2D2，即萃取壓力30 MPa，萃取溫度45 ℃，CO2流量25 kg/h，萃取時(shí)間3.0 h。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證該模型與測(cè)定可靠性，對(duì)最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行3次試驗(yàn)驗(yàn)證。在此條件下得到的羅漢果萃取物提取率平均值為10.08%，這說(shuō)明該模型條件是比較可靠的。

2.2 羅漢果萃取物樣品的揮發(fā)性成分分析

2.2.1 羅漢果萃取物揮發(fā)性成分總離子流圖

羅漢果萃取物GC-MS揮發(fā)性成分的總離子流圖見(jiàn)圖1。

2.2.2 GC-MS分離鑒定出的羅漢果萃取物揮發(fā)性成分

羅漢果萃取物GC－MS揮發(fā)性成分的結(jié)果見(jiàn)表8。

據(jù)表8可知，羅漢果萃取物的揮發(fā)性成分共鑒定出55種化合物，所得質(zhì)譜圖經(jīng)計(jì)算機(jī)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢測(cè)與標(biāo)準(zhǔn)圖譜核對(duì)，利用歸一化測(cè)定了各種成分的峰面積，其主要成分為：棕櫚酸（19.15%）、亞油酸（15.81%）、糠醛（11.06%）、苯乙醛（9.51%）、甘菊藍(lán)（3.32%）、4－環(huán)戊烯－1，3－二酮（3.28%）、2－乙酰基吡咯（3.17%）、5－甲基糠醛（2.04%）、亞油酸乙酯（1.87%）、鄰苯二甲酸單丁酯（1.42%）、2－乙基己酸（1.33%）、1－甲基吡咯－2－甲醛（1.12%）等。

3 結(jié)論

1）結(jié)合生產(chǎn)工藝、成本核算等多方面因素綜合考慮，超臨界CO2最佳萃取條件為A3B2C2D2，即萃取壓力30 MPa，萃取溫度45℃，CO2流量25 kg/h，萃取時(shí)間3.0 h。極差分析和方差分析的結(jié)果是一致的。

表8 羅漢果萃取物揮發(fā)性化學(xué)成分Table 8 The volatile compositions in the perfume of Siraitia grosvenorii flavor concret

續(xù)表8 羅漢果萃取物揮發(fā)性化學(xué)成分Continue table 8 The volatile compositions in the perfume of Siraitia grosvenorii flavor concret

2）揮發(fā)性成分分析分析結(jié)果表明超臨界CO2萃取工藝制備的羅漢果萃取物中含有大量的致香成分，如棕櫚酸、亞油酸、糠醛、苯乙醛等，還有多種脂肪酸類化合物和其它成分。

3）優(yōu)選得到的超臨界CO2萃取工藝穩(wěn)定、可行，通過(guò)該項(xiàng)研究為超臨界CO2提取技術(shù)在香精香料產(chǎn)品開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用和開(kāi)辟經(jīng)濟(jì)、高效且定向生產(chǎn)特色羅漢果香原料的新途徑提供了參考。

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