左芳雷，馬會勤，丁寅寅，趙建云，陳尚武，*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學 食品科學與營養(yǎng)工程學院，教育部-北京市功能乳品重點實驗室，北京 100083；2.中國農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學與生物技術學院，北京 100193）

類黃酮是一組廣泛存在于植物中的多酚類物質(zhì)，屬于次級代謝產(chǎn)物，是存在于植物的葉、花、果中的天然色素，因多呈黃色而被稱為類黃酮[1]。在植物中，類黃酮起到抑制酶活性，螯合金屬離子，抵御紫外線、自由基、病原微生物危害等作用[2-3]。類黃酮還具有許多重要的生物學功能，如抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗癌、調(diào)節(jié)血脂、雌激素樣作用等（注：“雌激素樣作用”學術上就是這種說法，英文為Estrogenic Effect）[4-5]。因此，類黃酮被廣泛應用于醫(yī)藥、食品和保健品行業(yè)中。

然而，類黃酮在植物中的含量很低，其提取率不超過干重的1%，而且成本高，不易標準化[6-7]。隨著現(xiàn)代生物技術的不斷發(fā)展，采用基因工程手段構建工程菌，使利用微生物發(fā)酵代謝生產(chǎn)類黃酮成為可能，為尋找類黃酮新來源開拓了新的方法和思路，具有重要研究和生產(chǎn)價值。

1 類黃酮的結構和功能

類黃酮泛指由2個苯環(huán)(A與B環(huán))通過中央三碳鏈相互結合的一系列C6-C3-C6化合物[1]，主要是指以2-苯基色原酮為母核的化合物。

天然的生物類黃酮多是其基本結構的衍生物，而且多以糖苷形式存在，因此植物界中存在各種各樣的類黃酮物質(zhì)，目前發(fā)現(xiàn)的已達6000余種[8]。黃酮類化合物根據(jù)其中央三碳鏈的氧化程度、B-環(huán)聯(lián)接位置（2－或3－位）以及三碳鏈是否構成環(huán)狀等特點，可分為8類[9]：黃酮（flavones）、黃酮醇（flavonols）、黃烷酮（flavanones）、異黃酮（isoflavones）、黃烷醇（flavanols）、黃烷酮醇（flavanonols）、查耳酮（chalcone）及花青素（anthocyanidins）。常見食品中黃酮類化合物種類與結構特點見表1[10]。

類黃酮具有突出的清除自由基、螯合金屬離子和抗氧化能力，這是由其特殊結構決定的。一般認為,生物類黃酮分子的α、β不飽和吡喃酮是其具有各種生物活性的關鍵[11-12]。7-OH糖苷化和2、3位雙鍵氫化均易引起類黃酮生物活性的降低，而A、B、C三環(huán)上的各種取代基則決定了其特定的生理功能。有效酚羥基理論[13]認為，B環(huán)上的3’和4’鄰二羥基對清除自由基和機體組織中的脂質(zhì)過氧化物起決定作用，而在抑制油脂自動氧化中，3-OH、5-OH、4-羰基和2、3 位的雙鍵則起主導作用。因此，清除超氧陰離子自由基的能力：蘆丁>槲皮素>桑色素>橙皮苷，而抑制油脂氧化的能力：槲皮素>桑色素>蘆丁≈橙皮苷。在離體條件下,類黃酮通過清除超氧陰離子和羥自由基抑制起始階段的脂類過氧化作用。類黃酮通過提供給過氧化基團氫原子產(chǎn)生類黃酮自由基終止自由基鏈式反應。類黃酮自由基反過來又和自由基團發(fā)生反應終止傳遞鏈。除了具有抗過氧化的性質(zhì),類黃酮上相鄰的羥基或酮基能夠螯合金屬離子,而金屬離子往往是氧化反應的催化劑和引發(fā)劑[14]。

表1 食品中常見黃酮類化合物和結構特點[10]Table 1 Common flavonoids and their structural features in food

2 植物中的類黃酮合成途徑

植物的代謝分為初級代謝和次級代謝。植物的次級代謝有多條途徑，苯丙烷代謝途徑從碳流的角度來看，是植物最重要的次生代謝途徑之一，也是目前研究的較為透徹的次生代謝途徑之一。在一個細胞中，有20%以上的代謝會通過這條途徑，一切含苯丙烷骨架的物質(zhì)都是由這一途徑直接或間接生成的[15]。苯丙烷代謝途徑產(chǎn)生木質(zhì)素、芪類、黃酮和花青素類化合物等次生代謝物的共同代謝物中間體，這些中間體參與后續(xù)代謝途徑就可以生成各種具有重要生物活性的植物次生代謝物。

類黃酮化合物是苯丙烷代謝途徑產(chǎn)物經(jīng)由類黃酮合成途徑得到的一系列植物次生代謝物，類黃酮合成途徑是苯丙氨酸代謝途徑的重要分支。主要包括苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸羥化酶（C4H）；4-香豆酸-輔酶A 連接酶(4CL)、查耳酮合成酶（CHS）、查耳酮異構酶（CHI）等幾個關鍵酶[16]。在這些次生代謝酶類中，PAL是研究的較為詳盡的酶，它使植物的次生代謝和初級代謝聯(lián)系起來。莽草酸途徑產(chǎn)生的苯丙氨酸經(jīng)PAL解氨作用生成反式肉桂酸，從而進入苯丙烷代謝途徑生成香豆酸、阿魏酸、芥子酸等中間產(chǎn)物，PAL同時具有酪氨酸解氨酶（TAL）活性，可以利用酪氨酸代謝得到相同的產(chǎn)物。這些酸經(jīng)C4H和4CL作用可進一步轉(zhuǎn)化為相應的輔酶A酯。C4H是第一個被鑒定的植物細胞色素P450酶[17]，也是第一個既被克隆、又確定了功能的植物細胞色素P450酶，該酶行使功能需氧且依賴NADPH，它催化苯丙烷代謝途徑的第一個氧化反應，在肉桂酸苯環(huán)結構的對位上催化位置特異性的羥化反應，將反式肉桂酸催化生成對-香豆酸；4CL催化各種羥基肉桂酸（香豆酸、阿魏酸、咖啡酸等）生成相應的輔酶A酯類。這幾步反應的產(chǎn)物及由這些產(chǎn)物經(jīng)過其它代謝分支所產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物統(tǒng)稱為苯丙烷類物質(zhì)。輔酶A酯類與3分子的乙酰輔酶A在CHS作用下生成查爾酮，由此進入類黃酮物質(zhì)代謝途徑。查爾酮是植物花青素類色素和植物類黃酮物質(zhì)合成的前體[18]，在CHI催化下，或者在堿性條件下自發(fā)地生成相應的黃烷酮。黃烷酮再經(jīng)過羥基化、烷化、氧化及糖苷化等反應就能得到許多具有重要生理功能的類黃酮物質(zhì)。如由異黃酮合成酶（IFS）催化到得異黃酮；由花青素合成酶（ANS）催化得到花青素；由黃酮醇合成酶（FLS）催化得到黃酮醇等。

3 利用微生物合成類黃酮

類黃酮物質(zhì)由于其重要的生理功能，尤其是清除自由基及抗癌防癌等作用，而在醫(yī)藥、食品等領域具有廣闊的應用前景。然而，類黃酮在植物中的含量很低，其提取成本高，得率低，品質(zhì)差，環(huán)境影響大；利用化學方法人工合成類黃酮也有很多局限，如安全性低，并且合成的類黃酮是兩種異構體的混合物，然而只有（2S）-類黃酮才具有生物活性[19]；通過植物細胞培養(yǎng)合成類黃酮也受到細胞存活期短、成本高、不易大規(guī)模培養(yǎng)等限制[20-21]；利用植物基因工程可以合成包括異黃酮在內(nèi)的類黃酮物質(zhì)，但是產(chǎn)量很低，主要是由于植物體中有眾多的代謝支流，導致物質(zhì)和能量向類黃酮合成方向的流動減弱[22]。

近年來，利用微生物發(fā)酵的方法合成類黃酮化合物迅速興起。微生物生長快、易培養(yǎng)，基因工程技術的便捷有效等等都是無與倫比的優(yōu)勢。在微生物中構建類黃酮生物合成途徑并進行發(fā)酵，有望實現(xiàn)類黃酮的大規(guī)模、工業(yè)化生產(chǎn)?，F(xiàn)在構建類黃酮生物合成途徑的主要宿主是大腸桿菌和釀酒酵母，而類黃酮合成相關基因的來源卻各有不同。

3.1 大腸桿菌

Hwang等[23-24]于2003年在大腸桿菌（E.coli）中構建來自紅酵母（Rhodotorula rubra）的PAL,來自天藍色鏈霉菌A3（2）（Streptomyces coelicolor A3（2）的4CL 和來自甘草（Glycyrrhiza echinata）的CHS多酶基因體系，分別以3套質(zhì)粒系統(tǒng)來表達代謝產(chǎn)生黃烷酮類物質(zhì)：PAL-4CL-CHS連接一個T7啟動子和一個核糖體結合位點(RBS)后與pET質(zhì)粒相連；3個基因分別攜帶各自的RBS，共同使用一個T7啟動子與pET質(zhì)粒相連；3個基因攜帶各自的T7啟動子和RBS與pET質(zhì)粒相連。攜帶第1套質(zhì)粒系統(tǒng)的工程菌株，可以以360 mg/L的酪氨酸和330 mg/L的苯丙氨酸為底物分別發(fā)酵得到0.570μg/L的柚皮素（Naringenin）和0.200μg/L的松屬素(pinocembrin)，攜帶第2套質(zhì)粒系統(tǒng)的工程菌株其產(chǎn)物的得率相比之下分別提高了85倍和43倍，而攜帶第3套質(zhì)粒系統(tǒng)的工程菌株其產(chǎn)物的得率卻得到了大幅度的提高，分別為794倍和3759倍，表明第3套系統(tǒng)代謝效率最高。這說明重組基因表達盒的組合方式對類黃酮物質(zhì)的代謝生成有很大影響。另外，其構建的途徑跳過了C4H基因，因為使用的4CL基因來自于天藍色鏈霉菌A3（2），該酶既可以使用對-香豆酸（p-coumaric acid）為底物，也可以直接作用肉桂酸（Cinnamate）參與后續(xù)反應[25]。代謝生成的松屬素和柚皮素為后續(xù)植物類黃酮物質(zhì)合成的重要前體。

不久，Watts等[26]在E.coli中導入了從模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）中克隆的PAL、C4H、4CL 和CHS基因，但因為難以表達得到有活性的C4H，所以反應在第1步過后就中止了。于是，他們加入外源的對-香豆酸，代謝得到柚皮素，加入外源3-（4-羥苯基）丙酸（3－（4－h(huán)ydroxyphenyl）propionic acid），代謝得到根皮素（phloretin），加入外源阿魏酸（ferulic acid）和咖啡酸（caffeic acid）卻沒有代謝得到相應的黃烷酮。該小組又用從紅假單胞菌（Rhodobacter sphaeroides）中克隆得到的酪氨酸解氨酶基因（TAL），替代了擬南芥PAL，并跳過了C4H，經(jīng)過48 h的發(fā)酵，可以代謝產(chǎn)生20.8 mg/L的柚皮素。

然而，以上研究所得到的類黃酮產(chǎn)量很低，不能進行大規(guī)模的合成。有研究者通過增加宿主體內(nèi)丙二酰輔酶A（Malonyl coenzyme A）的含量來提高類黃酮的合成。丙二酰輔酶A是大腸桿菌的限制性代謝物，也是合成黃酮類化合物的基礎材料，由乙酰輔酶A羧化酶（ACC）催化乙酰輔酶A（Acetyl coenzyme A）生成。但是，超表達內(nèi)源ACC卻對大腸桿菌有害[27]。Miyahisa等[28]將來自酵母的PAL，來自天藍色鏈霉菌A3（2）的ScCCL以及來自甘草的CHS，來自葛根（Pueraria）的CHI共同構建到pET載體上，另外，將來自谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）的乙酰輔酶A羧化酶基因（ACC）的兩個亞基（accBG和dtsR1）連接在pRSFDuet-1質(zhì)粒上，和上述pET表達載體共轉(zhuǎn)化大腸桿菌，可以大大提高柚皮素的產(chǎn)量，達到60 mg/L。

Leonard等[29]通過4個非同源質(zhì)粒將黃烷酮代謝途徑的幾個關鍵酶基因，即來自歐芹（Petroselinum crispum）的4CL，來自矮牽牛（Petunia x hybrida）的CHS和CHI，來自蘋果屬（Malus domestica）的黃烷酮3β-羥化酶基因（FHT），以及來自長春花（Catharanthus Roseus）的類黃酮3’,5’-羥化酶基因（F3’5’H）和P450還原酶基因（CPR），導入到大腸桿菌中，加入各種前體物質(zhì)，幾乎可以發(fā)酵產(chǎn)生除楊梅酮（myricetin）之外的所有黃酮類物質(zhì)。研究者又將來自發(fā)光桿菌（Photorhabdus luminescens）的ACC的4個亞基構建到載體上，和以上4CL-CHS-CHI多基因體系在大腸桿菌中共表達，可以代謝合成196 mg/L的松屬素和67 mg/L的柚皮素。由于ACC的羧化酶功能依賴于生物素連接酶（BPL，由birA基因編碼）的作用，所以研究者又將birA與以上表達載體共表達，結果松屬素產(chǎn)量增加到367 mg/L。然而，生物素昂貴，限制了類黃酮物質(zhì)的大規(guī)模發(fā)酵。研究者又將乙酰輔酶A合成酶基因（ACS）導入大腸桿菌，與4CL-CHS-CHI和ACC共表達，代謝得到383 mg/L的松屬素，外源添加少量的醋酸鹽可以使松屬素產(chǎn)量增加到429 mg/L[16]。

通過以上研究可見，設法提高宿主胞內(nèi)丙二酰輔酶A的含量對類黃酮物質(zhì)的大量合成有著重要意義。Leonard等繼續(xù)對此進行研究，通過增加宿主碳代謝途徑支路以及抑制非類黃酮合成途徑來增加類黃酮物質(zhì)合成的前體或輔因子，從而提高類黃酮的合成量。例如：將來自三葉草根瘤菌（Rhizobium trifolii）的基因matB和matC導入含有4CL-CHS-CHI重組基因的大腸桿菌宿主，可以將丙二酸鹽轉(zhuǎn)化為丙二酰輔酶A，添加外源丙二酸鹽的工程菌可以代謝合成480 mg/L的松屬素和155 mg/L柚皮素；為減少宿主本身丙二酰輔酶A的旁路流失，利用脂肪酸抑制劑淺藍菌素（cerulenin）抑制脂肪酸合成酶FabB/F，代謝得到的松屬素，柚皮素和圣草酚（eriodictyol）分別為710 mg/L，186 mg/L，和54 mg/L[30]。通過代謝工程手段調(diào)節(jié)大腸桿菌代謝網(wǎng)絡，使碳代謝流向丙二酰輔酶A合成的方向，為類黃酮合成所用，可以極大地提高類黃酮的得率[31]。

其它類黃酮化合物也通過相同手段在大腸桿菌中合成。Yan等[32]將來自蘋果屬的FHT和花青素合成酶基因（ANS），來自紅掌（Anthurium andraeanum）的二氫黃酮醇4-還原酶基因（DFR）和矮牽牛（Petunia hybrida）的UDP-葡萄糖：類黃酮3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因（UFGT）構建到大腸桿菌中，向培養(yǎng)基中添加68 mg/L的柚皮素或 28.8 mg/L的圣草酚，可以得到0.440 mg/L的山奈酚（Kaempferol）和 0.444 mg/L 的槲皮素（quercetin），但是花青素（Anthocyanin）的合成量卻很低。Miyahisa等[33]將來自歐芹的黃酮合成酶I基因（FNSI）導入含PAL-ScCCL-CHS-CHI重組基因的大腸桿菌中[28]，可由酪氨酸代謝生成13 mg/L的芹菜苷元（apigenin），由苯丙氨酸代謝生成9.4 mg/L的白楊素（chrysin）；將來自柑橘屬（Citrus）的FHT和黃酮醇合成酶基因（FLS）導入相同的工程菌中時，可由酪氨酸代謝生成15.1 mg/L的山奈酚，由苯丙氨酸生成1.1 mg/L的高良姜素（galangin）。另外還有一些黃酮類化合物也能在大腸桿菌中合成，但是合成量很低[34]。

郝佳等[35]利用單質(zhì)粒攜帶多個基因和多質(zhì)粒共同導入的方法，構建了2套具有不同抗性的同源性pET質(zhì)粒，將完全來自大豆（Glycine max）的PAL、4CL、CHS、CHI、IFS等基因重組到大腸桿菌中進行大豆異黃酮類物質(zhì)的代謝工程研究，但未見進一步報道。

總的來看，通過基因工程和代謝工程手段，各類類黃酮化合物幾乎都可以在大腸桿菌中合成，但是目的基因來源不同，其產(chǎn)物得率差異很大，其生物代謝產(chǎn)量目前尚不足以實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。另外，原核生物密碼子使用偏好性與植物差異較大，也是影響基因表達效率和產(chǎn)率的重要限制因素。

3.2 釀酒酵母

酵母菌是真核微生物，作為宿主系統(tǒng)比大腸桿菌有更多的優(yōu)勢。首先，酵母菌是公認安全的微生物，可用于食品行業(yè)；更重要的是，它能夠表達有生物活性的細胞色素P450酶。細胞色素P450酶是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上混合功能氧化酶系統(tǒng)的末端氧化酶，類黃酮化合物合成的相關基因，包括C4H、IFS等，都屬于P450酶。以酵母菌為宿主，可以使得植物源基因的翻譯后修飾及酶學調(diào)控都和植物類似。因此，酵母菌是理想的合成類黃酮化合物的宿主菌。

Ro和Douglas[36]首次在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中構建苯丙烷類代謝途徑起始多酶系基因PAL,C4H和CPR。分別由從白楊（Populus trichocarpa X Populus deltoides）來的兩種苯丙氨酸解氨酶基因PAL2和PAL4構建了兩個系統(tǒng)，PAL2-C4H-CPR和PAL4-C4H-CPR，研究了從苯丙氨酸到對-香豆酸過程中碳的代謝機制。另外，放射性標記實驗證實，在酵母菌中C4H可以利用宿主內(nèi)生的肉桂酸，而無需導入外源的PAL。

Jiang等[37]在釀酒酵母中構建來自紅冬孢酵母菌（Rhodosporidium toruloides）的PAL，來自擬南芥的4CL和來自金絲桃（Hypericum androsaemum）的CHS多酶基因體系，由于該系統(tǒng)利用了來自真菌的PAL，它同時具有酪氨酸解氨酶（TAL）活性，從而跳過了C4H。每個基因在各自的GAL10啟動子的控制下可以高效表達，由內(nèi)源苯丙氨酸和酪氨酸可代謝產(chǎn)生7 mg/L的柚皮素，0.8 mg/L松屬素，9 mg/L的根皮素，同時也檢測到了很多其它中間代謝物的產(chǎn)生。

Yan等[38]在釀酒酵母中導入來自擬南芥的C4H，來自歐芹的4CL，來自矮牽牛的CHS和CHI多基因體系，代謝生成類黃酮物質(zhì)并產(chǎn)生一系列中間代謝產(chǎn)物。此工程菌能以148.16 mg/L肉桂酸合成16.3 mg/L的松屬素，以164.16 mg/L對-香豆酸合成28.3 mg/L的柚皮素，以180.16 mg/L咖啡酸合成6.5 mg/L的圣草酚。Leonard等[39]再將來自歐芹的FNSI或來自金魚草（Antirrhinum majus）的FNSII，與來自酵母的CPR導入到含PALScCCL-CHS-CHI重組基因的酵母菌[29]?？梢源x合成芹菜苷元和木犀草素（luteolin），白楊素只有在fnsI表達時合成。

Katsuyama等[40]采取了酵母和大腸桿菌共同發(fā)酵的策略。大腸桿菌攜帶來自酵母的PAL，來自天藍色鏈霉菌的ScCCL，來自甘草的CHS，來自葛根的CHI和來自谷氨酸棒狀桿菌的ACC，酵母攜帶來自甘草的IFS，二者在添加了酪氨酸的培養(yǎng)基中共同發(fā)酵，可以由543 mg/L酪氨酸代謝產(chǎn)生6 mg/L的染料木素（genistein）。這說明，利用酵母和大腸桿菌雙宿主系統(tǒng)發(fā)酵合成類黃酮物質(zhì)是可行的，能夠避免細胞色素P450酶難以在原核生物中有效表達這一障礙。

然而，即便是酵母染色體本身攜帶CPR基因，但是當外源P450酶超表達時，酵母內(nèi)源CPR活性卻是限制性因素[41]。共表達植物源的CPR基因相比卻能提高產(chǎn)物的得率，說明酵母內(nèi)源CPR基因不足以支持P450酶的高效表達[41-42]。Trantas等[42]將來自白楊的PAL、CPR 基因，來自大豆的C4H、4CL、CHS、CHI、IFS、F3H（黃烷酮3-羥化酶基因）、F3’H（類黃酮3’-羥化酶基因）以及來自馬鈴薯（Solanum tuberosum）的FLS構建到釀酒酵母中，重組菌可以代謝得到8.9 mg/L～15.6 mg/L的柚皮素，0.1 mg/L～7.7 mg/L的染料木素，0.9 mg/L～4.6 mg/L的山奈酚以及0.26 mg/L～0.38 mg/L的槲皮素。

Naesby等[43]將類黃酮合成的相關基因構建到酵母人工染色體（YAC）上，使得重組基因可以在宿主中穩(wěn)定遺傳，可以代謝得到柚皮素0.858 mg/L，山奈酚0.235 mg/L，同時也得到了其它類黃酮物質(zhì)及中間產(chǎn)物。這是一個不同以往的在酵母菌中構建類黃酮代謝途徑的方法，允許合成多種結構不同的類黃酮化合物，而且遺傳穩(wěn)定性好。

3.3 其它微生物

Parka等[44]將來自天藍色鏈霉菌的ScCCL和來自擬南芥的CHS構建到表達載體pSE34（包含強啟動子PermE）上，導入到委內(nèi)瑞拉鏈霉菌（Streptomyces Venezuela）中。采取與H wang等[23]同樣的方法，構建兩類質(zhì)粒系統(tǒng)。當ScCCL和CHS分別攜帶各自的RBS，共用一個PermE啟動子時，可以代謝合成0.2 mg/L的柚皮素和0.4 mg/L的松屬素；當ScCCL和CHS分別攜帶各自的RBS和啟動子時，柚皮素和松屬素的合成量分別提高6倍（1.2 mg/L）和5倍(2.0 mg/L)。這再次說明重組基因表達盒的組合方式對產(chǎn)物的合成有很大影響。又將來自擬南芥的CHS進行了密碼子偏好性改造，結果柚皮素和松屬素的合成量顯著增加，達到4.0 mg/L和6.0 mg/L。這表明對外源基因進行密碼子優(yōu)化是提高產(chǎn)物合成量的有效途徑。

4 總結與展望

以上研究證明，利用大腸桿菌和釀酒酵母為宿主，構建類黃酮合成途徑，發(fā)酵生產(chǎn)類黃酮化合物是有效的，這表明利用基因工程以及代謝工程手段同樣可以發(fā)酵生產(chǎn)其它種類的天然化合物。另外，也可以考慮利用其它微生物為宿主，如絲狀真菌、乳酸菌、芽孢桿菌等。

在微生物中構建類黃酮合成途徑，最重要的一個障礙仍然是C4H、IFS等細胞色素P450酶的有效表達問題。C4H、IFS酶行使功能要依附于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，需氧且依賴NADPH，而大腸桿菌缺乏內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。一般的解決辦法是利用來自天藍色鏈霉菌的ScCCL替代植物4CL，同時跳過C4H。也有人利用TAL替代PAL，或者直接利用PAL的TAL活性發(fā)酵酪氨酸，也可以跳過C4H。另外，利用釀酒酵母和大腸桿菌共同發(fā)酵的方法，用酵母的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和P450還原酶來實現(xiàn)細胞色素P450酶的功能也是一個很好的選擇。還有研究者將P450酶與P450還原酶融合起來，形成嵌合體，也可以實現(xiàn)P450酶在大腸桿菌中的有效表達[16，45]，而在酵母菌中，不必將P450酶與P450還原酶融合，只要共表達二者就可以提高P450酶的活力[46]。

對于不同來源的類黃酮合成相關基因，在宿主菌中的表達效率各有不同。針對宿主菌的密碼子占用頻率，對目標基因進行密碼子優(yōu)化能夠提高基因在相應宿主中的表達效率。另外，目標基因的選擇及其表達元件的組合方式，合適的啟動子和相匹配的宿主菌選擇對類黃酮合成效率的影響也很大。利用基因工程手段超表達所需要的基因，同時抑制代謝支路的基因可以使能量及物質(zhì)向合成類黃酮的方向流動，從而提高類黃酮的合成產(chǎn)率。

在工程菌發(fā)酵過程中，利用發(fā)酵工程技術優(yōu)化培養(yǎng)條件，如工程菌培養(yǎng)密度以及不同的碳源、氮源等營養(yǎng)條件，可以使得工程菌最大限度地合成類黃酮。

總的來看，關于類黃酮化合物的微生物代謝工程的研究已經(jīng)有了很多基礎，可以實現(xiàn)工程菌發(fā)酵生產(chǎn)類黃酮。然而，利用微生物發(fā)酵實現(xiàn)類黃酮的大規(guī)模、工業(yè)化生產(chǎn)還需要更進一步的研究。

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