麥國(guó)琴，許曉萍，余翠媚，張立國(guó)，王娟

（深圳大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 深圳 518060）

纖維素是地球上分布最廣、蘊(yùn)藏量最豐富的生物質(zhì),也是最廉價(jià)的可再生資源。纖維素酶是一類能夠?qū)⒗w維素降解為葡萄糖的多組分酶系的總稱，它們協(xié)同作用，分解纖維素產(chǎn)生寡糖和纖維二糖，最終水解為葡萄糖[1]。纖維素酶可廣泛用于食品、紡織、飼料、釀酒、石油勘探、中藥成分提取等眾多領(lǐng)域，特別是在紡織、洗滌、造紙和生物能源等工業(yè)應(yīng)用上具有重要地位[2]。木聚糖是植物半纖維素的主要成分，是一種多聚五碳糖，且多以異質(zhì)多糖形式存在，與纖維素分子之間存在氫鍵連接和物理混合。木聚糖酶是一類降解木聚糖分子的復(fù)雜酶系，包括內(nèi)切β－1，4－木聚糖酶、β－D－木糖苷酶、α－L－呋喃型阿拉伯糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、酚酸酯酶等[3]。

南海沿岸紅樹林資源豐富，紅樹林(mangrove)是熱帶、亞熱帶海岸潮間帶的木本植物群落[4]。其生態(tài)系統(tǒng)是一個(gè)特殊復(fù)雜的生境，植物凋落物極其豐富，其中含有大量的纖維素、半纖維素等，紅樹林區(qū)絕大多數(shù)真菌都能產(chǎn)生降解纖維素和其他植物成分的酶[5]。目前，研究人員對(duì)陸地環(huán)境中的真菌研究較多[6-8]，而與紅樹林環(huán)境中真菌的分離鑒定、酶活及酶學(xué)性質(zhì)分析等的相關(guān)研究相對(duì)較少。本研究從深圳福田紅樹林土壤環(huán)境中篩選高產(chǎn)纖維素酶、木聚糖酶的真菌菌株，并對(duì)其進(jìn)行分子鑒定及酶學(xué)性質(zhì)的研究。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

樣品采自于深圳福田紅樹林表層0～15 cm的土壤，選擇10個(gè)采集點(diǎn)，每點(diǎn)采集樣品約10 g。

1.2 培養(yǎng)基

1）馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基[9]：葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，K2HPO41 g，MgSO4·H2O 0.5 g，瓊脂20 g，海水750 mL，加去離子水至1 L，121℃滅菌30 min，溫度降到50℃左右，加入青霉素、鏈霉素（其終濃度均為50μg/mL）。

2）液體種子培養(yǎng)基：mandels營(yíng)養(yǎng)鹽濃縮液100mL/L，mandels微量元素濃縮液1.0 mL/L，葡萄糖10 g/L，蛋白胨1 g/L，1 mol/L的檸檬酸緩沖液（pH 4.5）50 mL/L，吐溫801.5 mL/L。

3）纖維素酶產(chǎn)酶培養(yǎng)基：微晶纖維素粉30 g/L，mandels營(yíng)養(yǎng)鹽濃縮液200 mL/L，mandels微量元素濃縮液1.0 mL/L，葡萄糖3 g/L，蛋白胨1 g/L，1 mol/L的檸檬酸緩沖液（pH 4.5）50 mL/L，吐溫801.5 mL/L。

4）木聚糖酶產(chǎn)酶培養(yǎng)基：玉米芯粉30 g/L，mandels營(yíng)養(yǎng)鹽濃縮液200 mL/L，mandels微量元素濃縮液1.0 mL/L,葡萄糖3 g/L，蛋白胨1 g/L，1 mol/L的檸檬酸緩沖液（pH4.5）50 mL/L，吐溫801.5 mL/L。

1.3 方法

1.3.1 紅樹林土壤真菌的分離與篩選

將采集的樣品分別用無菌水適當(dāng)稀釋，涂布于馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)2d，挑取單菌落在馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線純化分離3次，得到純種的真菌。

將純化菌株（無菌水洗孢子3mL）接種于含有30mL液體種子培養(yǎng)基的三角搖瓶中，于28℃，250 r/min條件下振蕩培養(yǎng)2d后，再取3 mL的液體種子接種于含有30 mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基的三角搖瓶中于28℃，250 r/min條件下振蕩培養(yǎng)4 d后分別檢測(cè)其木聚糖酶及纖維素酶酶活。

1.3.2 木聚糖酶酶活測(cè)定

首先在試管中加入0.9 mL 0.5%的木聚糖溶液（由0.05 mol/L pH4.8的醋酸緩沖液配制）和0.1 mL適當(dāng)稀釋的酶液，50℃恒溫水浴20 min后加入2 mL 3，5-二硝基水楊酸（DNS）試劑終止反應(yīng)，煮沸5 min，冷卻后測(cè)定其540 nm下的吸光值，以木糖作標(biāo)準(zhǔn)。酶活定義：1 mL酶液在50℃和pH 4.8條件下，每分鐘水解木聚糖生成1 μmol木糖的量為1個(gè)酶活力單位，以IU表示。

1.3.3 纖維素酶活測(cè)定

在試管中加入0.9 mL 1%的微晶纖維素溶液（由0.05 mol/L pH4.8的檸檬酸緩沖液配制）和0.1 mL適當(dāng)稀釋的酶液，50℃恒溫水浴20 min后加入2 mL DNS試劑終止反應(yīng)，煮沸5 min，冷卻后測(cè)定其540 nm下的吸光值，以葡萄糖作標(biāo)準(zhǔn)。酶活定義：1 mL酶液在50℃和pH4.8條件下，每分鐘水解纖維素生成1 μmol葡萄糖的量為1個(gè)酶活力單位，以IU表示。

1.3.4 最適pH和最適溫度的測(cè)定

最適pH測(cè)定：配制pH1～pH12的緩沖液，分別在pH1～pH12條件下按照1.3.2及1.3.3方法測(cè)定木聚糖酶和纖維素酶活性。

最適溫度測(cè)定：用pH 4.8緩沖液配制底物，分別在10℃～80℃條件下按照1.3.2及1.3.3方法測(cè)定木聚糖酶和纖維素酶活性。

1.3.5 菌株的鑒定

形態(tài)觀察方法參考乳酸石碳酸棉藍(lán)染色液染色法[10]。

分子鑒定：提取真菌的基因組DNA,采用真菌5.8S rDNA通用引物ITS1及ITS4[11]擴(kuò)增菌株的5.8S rDNAITS（內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，internal transcriber spacer）序列，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收、測(cè)序，將所得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中序列進(jìn)行tblastx分析比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株概況

深圳福田紅樹林土壤樣品經(jīng)分離純化，在含抗生素的馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基上涂布、劃線、純化，共分離得到80株真菌。把這80株真菌分別接到液體種子培養(yǎng)基、產(chǎn)酶培養(yǎng)基上復(fù)篩，得到2株（菌株1和菌株2）同時(shí)具有較高木聚糖酶和纖維素酶活的真菌。經(jīng)測(cè)定，菌株1的木聚糖酶和纖維素酶活分別為42.16 IU和3.05 IU，菌株2的木聚糖酶和纖維素酶活分別為39.01 IU和0.87 IU。

2.2 2株紅樹林土壤真菌的形態(tài)觀察

菌株1和菌株2在馬丁氏培養(yǎng)基上的菌落特征和分生孢子結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1a顯示，菌株1在馬丁氏培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)7 d，直徑約60 mm，中間有臍狀突起而其他部分平坦；質(zhì)地絨狀；分生孢子大量產(chǎn)生；分生孢子面先是粉紅色，后來變成暗綠色，菌落反面為黃褐色。圖1b顯示，菌株2在馬丁氏培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)7 d，直徑約65 mm，平坦并具有輻射狀溝紋；質(zhì)地絲絨狀，分生孢子大量產(chǎn)生，主要聚集在菌落的中部，為灰褐色，菌落反面呈淡黃色。

圖1 菌株的菌落特征及分生孢子結(jié)構(gòu)Fig.1 Characteristics of colony and conidia structure of two strains

經(jīng)乳酸石碳酸棉藍(lán)染色液染色后，在40 X光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果如下：圖1c顯示，菌株1其分生孢子梗莖壁平；帚狀枝通常二輪生，偶有三輪生；?；枯?～4個(gè)，彼此較緊貼；分生孢子近似于橢圓形，分生孢子鏈近于圓柱狀。圖1d顯示，菌株2其分生孢子囊為球形；分生孢子梗老時(shí)黃色或黃褐色，壁平滑；頂囊球形；分生孢子近似于球形。

2.3 2株紅樹林土壤真菌的分子鑒定

利用真菌5.8S rDNA通用引物ITS1及ITS4，分別從菌株1和菌株2的基因組DNA中擴(kuò)增出一條特異性片段，序列大約600 bp。菌株1、2的基因組DNA及5.8S ITS PRC產(chǎn)物電泳圖分別見圖2、圖3。

圖2 兩菌株的基因組DNAFig.2 Genome DNA of two strains

圖3 兩菌株的ITS序列Fig.3 ITS sequence of two strains

將擴(kuò)增的ITS序列PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收、測(cè)序，并把測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中序列進(jìn)行tblastx比對(duì)分析，菌株1的ITS序列與Penicillium oxalicum strain XWSFJJ3（FJ977097）的相似性達(dá)到99.5%，同時(shí)結(jié)合形態(tài)觀察，可確定菌株1為草酸青霉（Penicillium oxalicum）；菌株2的ITS序列與Aspergillus piperis strain CBS 112811（FJ629352）的相似性達(dá)到99.6%，結(jié)合形態(tài)觀察，可確定菌株2為曲霉屬的Aspergillus piperis。

2.4 酶促反應(yīng)最適溫度的測(cè)定

在不同的溫度條件下測(cè)定菌株1和菌株2的木聚糖酶活見圖4。

圖4 木聚糖酶的最適溫度Fig.4 Optimum temperature of xylanase

由圖4可知，2種真菌的木聚糖酶活的最適溫度均為50℃，酶活分別為42.16 IU和39.01 IU；并且在40℃～60℃范圍內(nèi)都能保持67.1%以上的酶活，尤其菌株1在70℃下仍保持64.3%的酶活，說明該菌產(chǎn)生的木聚糖酶具有一定的耐熱性，有較好的應(yīng)用潛能。

在不同的溫度條件下測(cè)定菌株1和菌株2的纖維素酶活見圖5。

圖5 纖維素酶的最適溫度Fig.5 Optimum temperature of cellulase

同圖5可以看出，菌株1的纖維素酶的最適溫度是60℃，酶活為3.18 IU；菌株2的纖維素酶活的最適溫度是70℃，酶活為1.22 IU，盡管菌株2的纖維素酶活較低，但其具有一定的耐熱性，而且在30℃～80℃范圍內(nèi)酶活活性變化不明顯，說明溫度適用范圍較廣。

2.5 酶促反應(yīng)最適pH的測(cè)定

在不同的pH條件下測(cè)定菌株1和菌株2的木聚糖酶酶活，見圖6。

圖6 木聚糖酶的最適pHFig.6 Optimum pH value of xylanase

由圖6可知，菌株1木聚糖酶的最適pH為5.0，但在pH 4和pH 6時(shí)仍分別保持85.6%和84.1%以上的酶活；菌株2木聚糖酶的最適pH為4.0，在pH 4～8范圍內(nèi)酶活變化不明顯，說明該木聚糖酶的pH適用范圍較廣，有利于酶在工業(yè)中的應(yīng)用。但當(dāng)pH大于9時(shí)，兩菌的木聚糖酶活明顯下降，在pH 12時(shí)幾乎沒有酶活。不同pH條件下菌株1和菌株2的纖維素酶酶活見圖7。

圖7顯示菌株1和菌株2纖維素酶的最適pH均為3.0。菌株1和菌株2在pH 2～5范圍內(nèi)纖維素酶酶活變化不明顯，說明兩菌株均產(chǎn)生酸性纖維素酶。

圖7 纖維素酶的最適pHFig.7 Optimum pH value of cellulase

3 結(jié)論與討論

南海紅樹林產(chǎn)纖維素酶或木聚糖酶的土壤微生物廈門大學(xué)和海南大學(xué)已有報(bào)道[12-13]，但對(duì)分離菌株的分子鑒定及最適溫度、pH等特性并未有詳細(xì)數(shù)據(jù)。我們應(yīng)用分子生物學(xué)手段，對(duì)菌株進(jìn)行了分子鑒定，并對(duì)相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。

rDNA上的5.8、18和28 S rDNA基因有極大的保守性，同時(shí)絕大多數(shù)的真核生物都有極為廣泛的序列多態(tài)性，即親緣關(guān)系非常接近的2個(gè)種都能在ITS序列上表現(xiàn)出差異,顯示最近的進(jìn)化特征，這就是ITS序列在微生物種類鑒定的理論基礎(chǔ)[14]。從深圳福田紅樹林土壤環(huán)境中篩選的產(chǎn)纖維素酶、木聚糖酶的真菌菌株，根據(jù)ITS序列特征，本研究鑒定的2個(gè)菌株，其ITS序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知菌株的序列相似性均高于99.5%，結(jié)合形態(tài)觀察的結(jié)果，最終確定菌株1為草酸青霉（Penicillium oxalicum），菌株2為曲霉屬的Aspergillus piperis。

本實(shí)驗(yàn)中菌株2纖維素酶的最適溫度是70℃，屬于嗜熱纖維素酶[15]，可應(yīng)用于農(nóng)業(yè),使纖維素降解為糖,再由糖轉(zhuǎn)化為乙醇,產(chǎn)嗜熱纖維素酶的工程菌可在高溫條件下大量生產(chǎn)酒精，為能源建設(shè)開辟新途徑。本實(shí)驗(yàn)分離的兩菌株纖維素酶最適pH均為3.0，說明均具有較強(qiáng)的耐酸性，酸性纖維素酶可廣泛應(yīng)用于釀酒、釀醋、果汁等食品工業(yè)中[16]。

由于酸性木聚糖酶在pH 4.0以下時(shí)仍然保持較高酶活性，可廣泛應(yīng)用于飼料加工、釀酒工業(yè)、果汁加工等領(lǐng)域[17]。本研究所篩選的Penicillium oxalicum和Aspergillus piperis均具有較高的木聚糖酶酶活。今后將進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基組分，提高酶活性?？寺∠嚓P(guān)的功能基因，深入研究其酶學(xué)性質(zhì)，為開發(fā)新型纖維素酶和木聚糖酶制劑奠定基礎(chǔ)。

[1]Eveleigh DE.Cellulase:a perspective[J].Phil Trans Royal Soc Lond Ser A,1987(321):435-447

[2]邱雁臨.纖維素酶的研究和應(yīng)用前景[J].糧食與飼料工業(yè),2001(8):30-31

[3]Polizeli ML,Rizzatti AC,Monti R,et al.Xylanases from fungi:properties and industrial applications[J].Appl Microbiol Biotechnol,2005,67(5):577-591

[4]林鵬.紅樹林[M].北京:海洋出版社,1984:1-3

[5]曹啟民，鄭康振，陳耿，等.紅樹林生態(tài)系統(tǒng)微生物學(xué)研究進(jìn)展[J].生態(tài)環(huán)境，2008,17(2):839-845

[6]Bridge P,Spooner B.Soil fungi:diversity and detection[J].Plant and soil,2001,232(1):147-154

[7]吳萍,史鈞，駱丙國(guó).真菌木聚糖酶產(chǎn)生菌的篩選及酶學(xué)性質(zhì)研究[J].食品科學(xué),2009,30(1):159-163

[8]國(guó)春艷,刁其玉，喬宇，等.酸性木聚糖酶產(chǎn)生菌株的篩選和酶學(xué)性質(zhì)分析[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,43(7):1524-1530

[9]孔華忠.中國(guó)真菌志(青霉屬及其相關(guān)有性型屬)[M].北京:科學(xué)出版社,2007:22-23

[10]徐威.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2004:37-38

[11]White TJ,Bruns T.Analysis of phytogenetic relationships by amplification and direct sequencing of ribosomal RNA genes[M].New York Academic Press,1990:315-322

[12]蔣云霞.基于紅樹林土壤微生物資源研發(fā)的宏基因組學(xué)平臺(tái)技術(shù)的建立與應(yīng)用初探[D].廈門:廈門大學(xué)博士論文,2007：1-2

[13]高陽(yáng),劉四新，王春燕.紅樹林土壤中高產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選[J].熱帶農(nóng)業(yè)工程,2009,33(4):9-12

[14]陳劍山,鄭服叢.ITS序列分析在真菌分類鑒定中的應(yīng)用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,35(13):3785-3786

[15]張華鋒.纖維素酶研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,16(6):25-39

[16]劉春芬,賀稚非，蒲海燕，等.纖維素酶及應(yīng)用現(xiàn)狀[J].糧食與油脂,2004(1):15-17

[17]田永,侯運(yùn)華，于同立.酸性木聚糖酶的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].糧油加工,2008(5):110-113