姜宗豹，祖國仁，趙長新，凌猛

（1.華潤雪花啤酒（朝陽）有限公司，遼寧 朝陽 1224002.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034）

80年代，日本開發(fā)出發(fā)芽糙米，并已產(chǎn)業(yè)化、商業(yè)化。其營養(yǎng)成分比糙米大大提高。據(jù)日本資料報導(dǎo),長期食用發(fā)芽糙米,對人體機能和代謝的平衡、疏導(dǎo)十分有益而且發(fā)芽后的米還有潛在的價值，可以用做釀酒等用途。

發(fā)芽的主要目的是產(chǎn)生大量的水解酶如：α-淀粉酶、β-淀粉酶、蛋白酶、果膠酶等。在它們的共同作用下，使大麥中的淀粉和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)降解成小分子的糖類、氨基酸等供萌發(fā)使用，直接關(guān)系到成品米芽的質(zhì)量。本文選用日本大米為研究對象，檢測其發(fā)芽過程中α-淀粉酶、β-淀粉酶、蛋白酶的變化規(guī)律。為日本大米的發(fā)芽工藝的制定提供理論參考，同時為國產(chǎn)大米制作工藝提供借鑒。因此，本實驗意在充分利用大米的營養(yǎng)特性和功效性，將日本大米經(jīng)過糖化、煮沸、發(fā)酵，生成一種起泡、低酒精度的涼爽型飲品——日本大米啤酒。

1 材料與儀器

1.1 原料

日本大米：由日本秋田大學(xué)提供；酵母：大連工業(yè)大學(xué)保藏；麥芽：大連中糧麥芽有限公司提供。

1.2 儀器

ZPS-250H智能恒溫恒濕培養(yǎng)箱：黑龍江東拓儀器制造有限公司；HH恒溫水浴鍋：鞏義市英山谷予生化儀器廠；電子天平：A13104瑞士產(chǎn)；GTL-16A離心機：上海浦東物理光學(xué)儀器廠；WFJ7200可見光分光光度計：尤尼柯儀器有限公司；IEC離心機：美國Thermo公司；GC28A型氣相色譜；數(shù)顯筆式酸度計：pH-25型；啤酒自動分析儀；蒸汽高壓滅菌鍋：YX280B上海三申醫(yī)療器械有限公司。

2 實驗方法

2.1 日本大米發(fā)芽的3種工藝

浸2斷8工藝：濕浸2 h，干浸8 h。如此反復(fù)濕浸總共10 h，干浸共40 h。轉(zhuǎn)至發(fā)芽培養(yǎng)箱培養(yǎng)196 h。

浸4斷8工藝：濕浸4 h，干浸8 h。如此反復(fù)濕浸總共16 h，干浸共32 h。轉(zhuǎn)至發(fā)芽培養(yǎng)箱培養(yǎng)196 h。

浸4斷10工藝：濕浸4 h，干浸10 h。如此反復(fù)濕浸總共20 h，干浸共40 h。轉(zhuǎn)至發(fā)芽培養(yǎng)箱培養(yǎng)196 h。

2.2 粗酶液的制備方法

準(zhǔn)確稱取10 g米芽，用濾紙吸干米芽表面的水。將米芽放入用去離子水沖洗過的粉碎機（粉碎機要干燥）中粉碎。將粉碎的米芽放入糖化杯內(nèi)加去離子水90 mL，pH5.0的醋酸—醋酸鈉緩沖液10 mL。40℃水浴保溫攪拌1 h后，4000 r/min離心15 min，最后得到的上清液即為粗酶液。

2.3 α-淀粉酶活力與蛋白酶活力測定

具體測定方法詳見參考文獻[1]。

2.4 β-淀粉酶活力測定

具體測定方法詳見參考文獻[2]。

2.5 培養(yǎng)基制備及酵母擴培

參照參考文獻[3]。

2.6 焙焦

K1（排潮）：50℃（保溫2 h）→55℃（保溫2 h）→63℃（保溫2 h）→67℃（保溫10 h）

K2（焙焦）：60℃（保溫5 h）→83℃（保溫3 h）

2.7 日本大米米芽汁的制備

稱取干燥后的米芽80 g，粉碎放入糖化杯內(nèi)，由于日本大米芽大部分水解酶活力較大麥低，為防止因糖化時間過長而造成的水分過多損失，按料水比1∶5（g∶mL）的比例加入自來水；先在50℃攪拌糖化120 min，再將溫度上升至63℃，由于日本大米芽淀粉酶活力比大麥低很多。因此，為縮短糖化時間加入0.5%的液化酶和糖化酶，糖化分解階段時間為50 min～60 min；最后將溫度上升到70℃，用碘液檢測糖化的終點；過濾，用鹽酸調(diào)節(jié)濾液的pH為5.2，在100℃煮沸；將煮沸的醪液趁熱過濾，即得澄清的日本米芽汁。

2.8 發(fā)酵工藝的制定

將糖化的日本大米米芽汁用2層紗布過濾，煮沸20 min，用脫脂棉過濾，濾液用阿貝折光儀測定糖度并用水稀釋到10°P，分裝5瓶，用滅菌機在121℃高溫滅菌15 min，在無菌室向每瓶麥汁中加入擴培的酵母菌液9 mL，放入恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱于12℃發(fā)酵培養(yǎng)3d，然后再于14℃發(fā)酵培養(yǎng)4 d，最后在0℃下后貯7 d。

2.9 主要風(fēng)味物質(zhì)的測量

風(fēng)味物質(zhì)：采用GC28A型氣相色譜測定。

3 結(jié)果與討論

3.1 日本大米吸水實驗

取日本發(fā)芽大米擦干表面水分，烘干其水分，分別隔6、12、24 h測定其含水量，結(jié)果見圖1。

圖1 16℃不同工藝日本大米吸水曲線Fig.1 The water suction curves of Japanese rice under the different processes at 16℃

由圖1可以看出，隨著浸米時間的延長，日本大米的含量并非一直增加，而是呈現(xiàn)出波浪上升的趨勢。影響米粒吸水的因素有很多，如休眠性、水敏性、浸麥用水、添加劑、通風(fēng)與吸氧等。通過對實驗過程的分析，日本大米水含量上下波動的主要因素是通風(fēng)情況。浸米前日本大米的含水量為15%左右，在4 h之內(nèi)日本大米吸水量快速上升，浸2斷8工藝為25.5%，浸4斷8工藝為27.7%，浸4斷10工藝為25.1%。但米粒吸水后呼吸強度激增，需大量供氧。正常條件下，水中的氧只夠1 h之需（部分為微生物所耗），若過時不供氧，將導(dǎo)致分子內(nèi)呼吸，產(chǎn)生CO2、乙醇、醛、酸和酯類，這些物質(zhì)將影響米粒的生理狀況，從而直接影響到日本大米對水分的吸收，這可能是導(dǎo)致28 h～100 h期間日本大米含水量沒有增加的緣故。浸米24 h后，要對日本大米適當(dāng)換水、翻動，經(jīng)過這些處理，又為日本大米提供了充足的氧氣，并可除去分子內(nèi)呼吸所產(chǎn)生的有害物質(zhì)，使日本大米的生理狀況恢復(fù)，再次恢復(fù)吸水，導(dǎo)致日本大米總體含水量再度上升了。在第100小時后日本大米的含水量穩(wěn)步上升但總體上的波動不大，其中浸4斷10的方法吸水水分最充分為36.4%，浸4斷8方式為33.6%，浸2斷8方法為36.3%。吸收水分的快慢以及多少一般能間接反應(yīng)其活力的大小。

3.2 不同發(fā)芽工藝對α-淀粉酶活力的影響

在發(fā)芽期間每天定時測定日本大米的α-淀粉酶活力，結(jié)果見圖2。

圖2 發(fā)芽過程中α-淀粉酶活力變化Fig.2 Change of α-amylase acitivity during germination

由圖2可以看出，α-淀粉酶的活力是波動上升的，在前120 h浸2斷8，浸4斷8，浸4斷103種工藝的酶活力相差不大，都是波動上升。但從120 h之后3種工藝的酶活增漲較快，在144 h 3種工藝的酶活都達到最大，浸4斷10工藝為1.128753×10-7Kat/g（絕干），浸4斷8工藝為0.8684×10-7Kat/g（絕干），浸2斷8工藝的酶活為0.676517×10-7Kat/g（絕干）。之后3種工藝的酶活力都有所下降，這是因為隨著發(fā)芽時間增加，其它影響因素如發(fā)芽產(chǎn)生的副產(chǎn)物也對酶活產(chǎn)生影響，能夠抑制酶活力。

3.3 不同發(fā)芽工藝對β-淀粉酶活力的影響

在發(fā)芽期間每天定時測定日本大米的β-淀粉酶活力，結(jié)果見圖3。

圖3 發(fā)芽過程中β-淀粉酶活力變化Fig.3 Change of β-amylase acitivity during germination

由圖3可以看出，在發(fā)芽過程中，大米的β-淀粉酶活力保持增加趨勢，在144 h達到最大浸2斷8工藝為1.520034×10-7Kat/g（絕干），浸4斷8工藝為1.809779×10-7Kat/g（絕干），浸4斷10工藝為2.323805×10-7Kat/g（絕干）。之后酶活力有所下降，這是因為發(fā)芽時間過長，大米體內(nèi)的呼吸消耗大，無氧發(fā)酵現(xiàn)象比較嚴重，造成的酶活力下降。但是浸4斷10工藝β-淀粉酶活力總體上是最大的。在發(fā)芽初期，可以看出浸4斷10工藝的酶活力增漲最快。大米中含有活化和未活化的2種β-淀粉酶，β-淀粉酶屬于蛋白質(zhì)，蛋白含量高的大米，其酶活性也應(yīng)該高。但是，由于未活化的β-淀粉酶與不溶性的蛋白質(zhì)成雙硫鍵結(jié)合，當(dāng)這個雙硫鍵被蛋白酶切斷后，未活化的β-淀粉酶才有活性。有研究表明，β-淀粉酶活性與糖化力呈正相關(guān)[4]。因此，在制做發(fā)芽大米時候可考慮添加某些物質(zhì)（如金屬離子Na+）或降低發(fā)芽溫度來提高β-淀粉酶活力。

3.4 不同發(fā)芽工藝對蛋白酶活力的影響

在發(fā)芽期間每天定時測定日本大米的蛋白酶活力，結(jié)果見圖4。

圖4 發(fā)芽過程中蛋白酶活力變化Fig.4 Change of protease activity during germination

由圖4可以看出，在發(fā)芽過程中，蛋白酶活力的變化和大小基本相同。前96 h酶活力基本處于水平狀態(tài)但在96 h之后3種工藝的酶活力顯著升高。浸2斷8工藝從337.5731×10-7Kat/g（絕干）升高到1664.271×10-7Kat/g（絕干），浸4斷8工藝從309.7793×10-7Kat/g（絕干）升高到1675.877×10-7Kat/g（絕干），浸4斷10工藝從332.9509×10-7Kat/g（絕干）升高到1837.359×10-7Kat/g（絕干）。發(fā)芽結(jié)束時，即196 h時蛋白酶活力略有下降。浸2斷8工藝為1527.927×10-7Kat/g（絕干），浸4斷8工藝為1572.355×10-7Kat/g（絕干），浸4斷10工藝為1592.917×10-7Kat/g（絕干）。這是因為發(fā)芽后期供氧不及時，導(dǎo)致分子間呼吸產(chǎn)生CO2、乙醇、醛、酸和酯類，導(dǎo)致酶活有所降低的原因。

3.5 發(fā)酵結(jié)束后風(fēng)味物質(zhì)檢測結(jié)果

發(fā)酵結(jié)束后風(fēng)味物質(zhì)檢測結(jié)果見表1。

高級醇是啤酒發(fā)酵代謝副產(chǎn)物的主要成分，在啤酒中適量高級醇的存在，能使酒體豐滿圓潤、香氣協(xié)調(diào)，但含量過高，則給人以腐臭感和刺激氣味，在飲酒不多時就會“上頭”，引起頭痛；一般情況下，下面發(fā)酵的啤酒總高級醇的含量以60 mg/L～100 mg/L較適宜[5]，從實驗檢測數(shù)據(jù)看，發(fā)酵后的大米啤酒高級醇含量102.30 mg/L，含量略高；啤酒中乙醛的含量影響啤酒口味的成熟，當(dāng)乙醛含量超過閾值（10 mg/L左右）時，給人以不愉快的粗糙苦味感覺，含量過高則有一種辛辣的腐爛青草味[6-7]，從實驗檢測數(shù)據(jù)看，乙醛含量為20.0 mg/L，高于閾值，品嘗過程中也有明顯的不愉快刺激味；優(yōu)質(zhì)啤酒中醇酯比一般控制在3∶1～4∶1左右的水平[8]，合適的醇酯比會讓啤酒口感協(xié)調(diào)[9]，從實驗檢測數(shù)據(jù)看醇酯比較高，主要是酯含量較低,而酯是啤酒風(fēng)味物質(zhì)體系中的重要成分[10]。

表1 第1次發(fā)酵結(jié)束后風(fēng)味物質(zhì)檢測結(jié)果Table 1 The result of the flavor substance after the first fermentationmg/L

3.6 利用不同工藝進行發(fā)酵

為解決高級醇、乙醛含量較高以及醇酯比不協(xié)調(diào)的問題，我們從新設(shè)計實驗增加米芽汁氮源，降低降糖速速，具體為：麥芽∶米芽=30%∶70%，恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱于10℃發(fā)酵培養(yǎng)3d,然后再于12℃發(fā)酵培養(yǎng)4 d，最后在0℃下后貯7 d。發(fā)酵結(jié)束后風(fēng)味物質(zhì)檢測結(jié)果見表2。

表2 第2次發(fā)酵結(jié)束后風(fēng)味物質(zhì)檢測結(jié)果Table 2 The result of the flavor substance after the second fermentationmg/L

通過改變工藝，發(fā)酵后的啤酒乙醛含量從40.3mg/L降到13.3mg/L，高級醇含量從102.3mg/L降到92.25mg/L，醇酯比從7.84∶1降到4.98∶1。通過品嘗，酒體自然柔和，口感協(xié)調(diào)，并有明顯的米香和麥芽香味。

4 結(jié)論

大米啤酒呈淺黃色，口味純正、口感細膩、協(xié)調(diào)，帶有米的清香味，酒液均勻無分層，無雜質(zhì)，是一種營養(yǎng)、稍有殺口力的休閑型飲料，其市場前景極為廣闊，值得國內(nèi)食品企業(yè)大力開發(fā)和利用。另外，由于目前原材料價格上漲，再加之啤酒市場競爭激烈，各大啤酒廠都在最大程度的增加輔料的用量，有些啤酒廠輔料量已達到50%。用大米為主料，再輔以小比利的麥芽，通過特定工藝，制作出能滿足市場消費需求以及有市場競爭力的啤酒，將對啤酒行業(yè)影響深遠。同時也得出日本大米發(fā)芽時的最優(yōu)酶活力：在浸4斷10工藝下，144 h時α-淀粉酶，β-淀粉酶，蛋白酶最高分別為：1.128753×10-7Kat/g（絕干）、2.323805×10-7Kat/g（絕干）、1837.359×10-7Kat/g（絕干）。這同時也對以后以國產(chǎn)大米為原料做了參考。

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