王秀霞，王金，徐國念，萬端極，*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 化學(xué)與藥學(xué)院，山東 青島 266109；2.湖北工業(yè)大學(xué)膜技術(shù)研究所，湖北 武漢 430068）

正如許多研究[1-3]認(rèn)為，水解度是影響肽質(zhì)量和產(chǎn)量的重要因素，水解度控制著肽段大小、游離氨基酸的相對含量。肽段過長，則具有生理活性的氨基酸殘基未能斷裂，就無法顯現(xiàn)出相應(yīng)的活性；水解過于完全，肽鏈進(jìn)一步水解為游離氨基酸，則一些具有活性的短肽也被水解，從而導(dǎo)致活性明顯降低。文獻(xiàn)報道[4-5]，具有生物活性的肽段不僅與活性氨基酸的含量有關(guān)，還與氨基酸組成與序列有關(guān)，通常認(rèn)為，具有活性的小分子肽比組成他們的游離氨基酸活性更高，因此在合適的水解時間終止酶解反應(yīng)來控制水解度是非常有必要的。

目前對蛋白質(zhì)酶解的動力學(xué)研究國內(nèi)外均有報道，如Tello[6]研究了Protease660L、Alealase0.6L和PEM 2500s 3種酶水解乳清蛋白的動力學(xué)模型；Marquez[7]研究了以血紅蛋白為底物的堿性蛋白酶催化水解的動力學(xué)模型；鄧尚貴[8]等探討了復(fù)合酶水解青鱗魚水解動力學(xué)模型。本研究以產(chǎn)量最大且價格低廉的淡水白鱗魚蛋白為酶解底物，采用Alcalase、Protamex雙酶水解，在前人總結(jié)公式上進(jìn)行水解度動力學(xué)模型探討，驗證了鰱魚蛋白復(fù)合水解體系水解度模型參數(shù)，期望通過控制酶解過程來獲得較強、較純的生物活性肽，簡化工業(yè)生產(chǎn)操作過程，降低后續(xù)分離純化成本，為低值魚深加工探索方向。

1 材料及方法

1.1 材料與試劑

氫氧化鈉、Alcalase、Protamex：購于諾維信；白鰱魚：市場購買，去頭，攪碎。

1.2 主要儀器與設(shè)備

絞肉機(jī)：鎮(zhèn)江市京口區(qū)食品機(jī)械廠；FA2000N型分析天平：上海名橋精密科學(xué)儀器有限公司；數(shù)顯pH計：杭州奧立龍儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海嘉程儀器設(shè)備廠。

1.3 方法

用Alcalase、Protamex雙酶水解鰱魚蛋白，通過單因素確定最佳酶解條件為：溫度55℃，pH7.5，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)w（底物蛋白）=4.5%，水解180 min。以復(fù)合酶用量分別為底物蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)，即w（酶量）為:0.5%、1.0%、1.5%、2%、2.5%、3%加入水解體系，在反應(yīng)過程中加入2 mol/L的NaOH溶液維持pH恒定，記錄各個時間堿液用量，計算水解度（DH）。

水解度（DH）計算—pH-Stat法[9]

水解度定義為已水解的肽鍵數(shù)與原料中總肽鍵數(shù)的比值。

式中：B為堿液的體積，L；Nb為所用堿的濃度，mol/L；Mp為底物蛋白總量，g；α為氨基解離度，htot為原料中總肽鍵數(shù)，對于魚蛋白htot=8.6 mmol/g[10]。其中氨基解離度的計算公式如下：

其中pH為酶解時pH，pKa的計算公式如下[11]：

T為水解時的開爾文溫度。

2 結(jié)果與分析

根據(jù)前人[7]的研究有：

食物蛋白酶解均符合該公式。由公式（4）可以看出，水解度是一個關(guān)于反應(yīng)時間的函數(shù)。對公式積分得：

式中：t為水解時間，min，此公式適用于所以蛋白質(zhì)水解體系，對于不同的反應(yīng)體系a、b值不同，而對于同一反應(yīng)體系，a、b為常數(shù)。本研究以前面的試驗條件來驗證此動力學(xué)模型，結(jié)果如圖1。

從圖1中可以看出，各酶/底物蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，水解度似乎與時間呈現(xiàn)某種非線性函數(shù)關(guān)系，為了驗證公式（5）是否符合試驗結(jié)果，以公式（5）為函數(shù)，分別對以上6組數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性對數(shù)擬合，擬合效果圖見圖2（a-f）。

從圖2各個圖的擬合結(jié)果可以看出，各加酶量下鰱魚蛋白酶解體系的水解度實測值與公式（5）模型擬合的結(jié)果相當(dāng)吻合，6個圖均顯著相關(guān)，因此可以認(rèn)為鰱魚蛋白雙酶水解體系符合對數(shù)模型，即說明前面所建立的動力學(xué)模型既具有理論意義又有實際應(yīng)用價值。為了確定公式（5）中a，b值分別代表什么，我們將上面6個對數(shù)擬合而計算出的a，b列于表1。

圖1 不同酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)的水解圖Fig.1 Hydrolysis curves for different initial enzyme weight percentage

圖2 不同酶／底物蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)對數(shù)擬合圖Fig.2 Logarithm curves fit of different initial enzyme weight percentage

表1 不同酶濃度水解動力學(xué)參數(shù)a與b值Table 1 The parameter a，b of enzyme kinetics of different concentration of enzyme

從表1的數(shù)據(jù)可以看出，b值各酶量下數(shù)值較接近，并不隨酶量的改變而呈現(xiàn)某一規(guī)律變化，而a值則明顯的隨著酶量的增加而變大。

將加酶量與底物蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)換算成加酶量與蛋白質(zhì)量比值，結(jié)合表1可以得出結(jié)論，b值與加酶量無關(guān)，對于這一鰱魚蛋白反應(yīng)體系：復(fù)合酶Alcalase+Protamex，水解溫度55 ℃，pH7.5，b值為常數(shù)，平均值為0.2351；將6個a值抽提出來，以e/s（%）為橫坐標(biāo)，a為縱坐標(biāo)作圖，并進(jìn)行線性擬合，結(jié)果見圖3。

圖3 不同蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)對數(shù)擬合圖Fig.3 Logarithm curves fit of different protein concentrations

由圖3可看出，a值與酶量/底物蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)顯著的線性相關(guān)性，其線性關(guān)系式為：y=1.13415x-0.33791，即a值與e/s的關(guān)系式為：a=1.13415e/s-0.33791，b=0.2351，即水解度

為了驗證水解度動力學(xué)模型實際指導(dǎo)意義，以e/s（%）為1.8、2.4，相同酶解溫度和pH條件下試驗，對比DH模型計算結(jié)果與實測值，結(jié)果見圖4。

圖4 實測水解度與理論水解度比較Fig.4 Comparison of experimental DH and calculated DH

由此可以認(rèn)為：所建立的動力學(xué)模型具有實際指導(dǎo)價值，根據(jù)試驗結(jié)果推導(dǎo)的鰱魚蛋白復(fù)合酶水解體系的模型參數(shù)也是可信的。這對于工業(yè)生產(chǎn)實際操作具有指導(dǎo)意義，不用繁瑣的記錄加堿量來計算水解度，只要復(fù)合酶種類、底物濃度和溫度不變，即可通過控制加酶量和水解時間來控制水解度以獲得目標(biāo)產(chǎn)物。

3 結(jié)論

在恒定水解溫度與pH值條件下，通過試驗驗證，確定Alcalase、Protamex復(fù)合酶水解鰱魚蛋白體系水解過程遵循DH=1/bln（1＋abt）這一動力學(xué)模型，經(jīng)過數(shù)據(jù)擬合推算出模型參數(shù)a=1.134 e/s-0.3379，b=0.2351。驗證試驗表明，理論計算水解度與試驗所測水解度基本吻合。

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