李偉，姜媛，唐曉珍，董玉秀，張憲省

1(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安，271018)

2(山東省科學(xué)技術(shù)情報(bào)所，山東濟(jì)南，250101)

大孔樹(shù)脂純化黑粒小麥麩皮色素及其初步鑒定*

李偉1，姜媛2，唐曉珍1，董玉秀1，張憲省1

1(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安，271018)

2(山東省科學(xué)技術(shù)情報(bào)所，山東濟(jì)南，250101)

研究了AB-8型大孔樹(shù)脂對(duì)黑粒小麥麩皮色素的吸附與解吸條件，并利用高效液相色譜法對(duì)純化后的色素成分進(jìn)行了初步的分析。結(jié)果表明:黑粒小麥麩皮色素在AB-8型大孔樹(shù)脂上的吸附平衡時(shí)間為26 h，解吸平衡時(shí)間為7h，pH對(duì)大孔樹(shù)脂的吸附率影響不大，pH值為1.0的70%的乙醇溶液可以很好的洗脫色素。在該條件下，測(cè)得AB-8型大孔樹(shù)脂最大吸附率為83.00%，最大解吸率為85.53%。純化后的色素有4個(gè)主要成分，為花色苷類(lèi)化合物。

黑粒小麥麩皮，花色苷，大孔樹(shù)脂

彩粒小麥?zhǔn)侵缸蚜９N皮或糊粉層顏色與生產(chǎn)上常用小麥不同的小麥，現(xiàn)已經(jīng)報(bào)道的有紫粒、黒粒、藍(lán)粒、藍(lán)紫粒、綠粒小麥等，含有豐富的花色苷［1－2］，花色苷是花青素與糖以糖苷鍵結(jié)合而成的一類(lèi)化合物，具有有促進(jìn)視紅素再合成、抗炎癥、提高免疫力、抗心血管疾病、抗衰老、抗癌等多種生理功能，在食品、藥品、化妝品等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景［3］。

國(guó)內(nèi)外對(duì)彩粒小麥色素的研究主要集中在提取、生理功能及成分分析等方面［1－4］，關(guān)于純化的研究較少。目前對(duì)于花色苷類(lèi)化合物純化的方法主要有大孔樹(shù)脂精制法、超濾法及高速逆流色譜法，其中大孔樹(shù)脂法以其吸附容量大、選擇性好、成本低、再生簡(jiǎn)便且成本低等特點(diǎn)被廣泛用于天然產(chǎn)物的分離純化［5－6］。為了對(duì)黑粒小麥中的花色苷資源進(jìn)行全面的開(kāi)發(fā)利用和深加工，本實(shí)驗(yàn)以黑粒小麥麩皮為原料，AB-8型大孔樹(shù)脂的對(duì)其吸附和解吸性能進(jìn)行了研究，并利用高效液相色譜對(duì)純化后的組分進(jìn)行了初步的分析鑒定。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

黑粒小麥麩皮:黑粒小麥由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)孫蘭珍老師培育、提供。將籽粒洗凈晾干，磨粉得黑粒小麥麩皮。

1.2 試驗(yàn)儀器

UV-2501PC型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司;BS-150A電子天平，上海友聲衡器有限公司;HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇常州國(guó)華電器有限公司;酸度計(jì)，美國(guó)Thermo公司;TDL-5-A離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠;SHZ-ⅢD型循環(huán)水真空泵，上海亞榮生化儀器廠;超高效液相色譜儀-質(zhì)譜儀，美國(guó)沃特世(Waters公司);Sun FireTMC18(4.6 mm ×150 mm，5 μm)色譜柱，美國(guó)Waters公司。

1.3 試驗(yàn)試劑

無(wú)水乙醇、HCl、NaOH，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司，均為分析純?cè)噭?乙腈、甲醇、乙醇，均為色譜純，美國(guó)Fisher公司;甲酸，美國(guó)Alfa Aesar公司;AB-8型大孔吸附樹(shù)脂，天津偉強(qiáng)鍋爐凈化材料有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 黒粒小麥麩皮色素提取物的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)量黒粒小麥麩皮1.00 g，用pH值1.0的體積分?jǐn)?shù)為40%的乙醇溶液按料液比1∶20(g∶mL)比例加入提取劑，于70℃下浸提80 min，倒出上層液冷卻至室溫，離心10 min(轉(zhuǎn)速4 800 r/min)，除去沉淀得色素提取液。

1.4.2 黒粒小麥麩皮色素吸收光譜圖及測(cè)定方法

用UV-2550型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在200～600 nm波長(zhǎng)內(nèi)掃描，以提取劑為參比，測(cè)色素提取液的吸收光譜，以最大吸收波長(zhǎng)(λmax)處的吸光度值表示色素的濃度［6］。

1.4.3 AB-8型大孔樹(shù)脂純化黑粒小麥麩皮色素

1.4.3.1 樹(shù)脂的活化

取新買(mǎi)來(lái)的AB-8型大孔樹(shù)脂用去離子水洗凈，在燒杯內(nèi)加入高于樹(shù)脂層10 cm的體積分?jǐn)?shù)95%乙醇在室溫下密封浸泡8 h，用去離子水洗至中性后用5%的HCl浸泡8 h，去離子水洗至中性后再用5%NaOH浸泡8 h，用蒸餾水洗至中性后裝柱，用95%乙醇洗至流出液用水稀釋不渾濁為止，再用去離子水洗至無(wú)醇?xì)馕?，備用?/p>

1.4.3.2 樹(shù)脂吸附率和解吸率的測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取預(yù)處理的大孔樹(shù)脂若干份，每份各2.0 g置于100 mL錐形瓶中，再加入50 mL pH值為1.0的色素提取液，最大吸收波長(zhǎng)(λmax)處測(cè)其吸光值。充分吸附24 h后，測(cè)定其在最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度A1，向?yàn)V出的樹(shù)脂中加入50 mL pH值1.0的體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液，振蕩24 h，充分解吸后過(guò)濾測(cè)濾液的吸光度值A(chǔ)2，計(jì)算其吸附率α和解吸率β［7］。

式中:A0，色素溶液純化前的吸光度值;A1，大孔樹(shù)脂吸附色素后溶液的吸光度值，A2，大孔樹(shù)脂解吸后色素溶液吸光度值。

1.4.3.3 吸附平衡時(shí)間和解吸平衡時(shí)間的測(cè)定

取已預(yù)處理的樹(shù)脂2 g加入pH值為1.0的色素提取液20 mL在水浴振蕩器內(nèi)以150 r/min，每隔0.5 h進(jìn)行測(cè)定吸光值，直到數(shù)值穩(wěn)定為止，測(cè)定吸附平衡時(shí)間;取已吸附好的樹(shù)脂2 g若干份，每份加20 mL洗脫劑在水浴振蕩器內(nèi)以150 r/min，每隔0.5 h進(jìn)行測(cè)定吸光值，直到數(shù)值穩(wěn)定為止，測(cè)定解吸平衡時(shí)間。

1.4.3.4 pH值對(duì)AB-8型大孔樹(shù)脂吸附的影響

稱(chēng)取經(jīng)預(yù)處理的AB-8型大孔樹(shù)脂5份，每份2 g色素提取液分別調(diào) pH 值至 1.0、2.0、3.0、4.0、，分別加入25 mL至錐形瓶中，于搖床150 r/min吸附24 h，測(cè)定色素溶液在可見(jiàn)光最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度，計(jì)算吸附率。

1.4.3.5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)AB-8型大孔樹(shù)脂解吸率的影響

取吸附花色苷飽和的大孔樹(shù)脂2 g若干份，加入體積分?jǐn)?shù)為30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的pH值1.0的乙醇溶液25 mL，30℃150 r/min吸震蕩2 h，取洗脫的花色苷溶液1 mL，λmax處測(cè)定吸光度值，計(jì)算解吸率。

1.4.3.6 大孔樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)

通過(guò)查閱資料文獻(xiàn)確定吸附流速和洗脫流速，對(duì)大孔樹(shù)脂裝層析柱后對(duì)色素提取液進(jìn)行純化:采用pH值為1.0，吸光度值為0.6的色素溶液進(jìn)行上樣，流速為3 BV/h上柱，選擇pH=1的70%的乙醇水溶液解吸溶劑，洗脫流速1BV/h。

1.4.3.7 色價(jià)的測(cè)定

精確稱(chēng)取自制的花色苷0.05 g，用pH值3.0的檸檬酸緩沖液定容至100 mL容量瓶中，稀釋至一定倍數(shù)，在520 nm處測(cè)定其吸光度值，用公式:色價(jià)=A×r/m計(jì)算色價(jià)，式中A為吸光度值，r為測(cè)定時(shí)所吸取的樣品的稀釋倍數(shù)，m為樣品的質(zhì)量(g)［8］。

1.4.4 高效液相色譜法對(duì)純化后黑粒小麥麩皮色素的初步分離鑒定

應(yīng)用超高效液相色譜系統(tǒng)配以光電二極管陣列檢測(cè)器［9］。樣品分離采用Sun FireTMC18(4.6 mm×150 mm，5 μm)色譜柱，柱溫 40℃。運(yùn)行時(shí)間:20.00 min，梯度洗脫，流動(dòng)相A為甲醇，B為0.1%甲酸水，0～13 min:A由10%的變?yōu)?2%，B由90%的變?yōu)?8%;13～15 min:A由52%變?yōu)?0%，B由48%變?yōu)?0%;15～17.5 min:A由90%變?yōu)?0%，B由10%變?yōu)?0%，流速為0.800 mL/min，進(jìn)樣體積:10ul。光電二極管陣列檢測(cè)器掃描范圍200～800 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 光譜特征

圖1 黑粒小麥麩皮色素紫外全掃描圖(200～800 nm)

由圖1可見(jiàn)，以pH值=1.0的乙醇浸提，所得色素提取液在紫外光區(qū)280～285 nm有較強(qiáng)的吸收峰，為花色苷化合物特征峰;在可見(jiàn)光范圍內(nèi)的最大吸收在525 nm處，為典型的花青素光譜特性［10］。自然界花青素多以與糖苷鍵結(jié)合的形式存在，所以推斷黑粒麩皮色素為花色苷類(lèi)，這與前人研究結(jié)果相符［1－2］，確定最大吸收波長(zhǎng)(λmax)為525 nm。

2.2 AB-8型大孔樹(shù)脂對(duì)黑粒小麥麩皮色素的純化

2.2.1 吸附率、靜態(tài)吸附時(shí)間的測(cè)定

圖2 AB-8型大孔樹(shù)脂對(duì)黒粒小麥麩皮色素的吸附率隨時(shí)間的變化

由圖2可以看出，AB-8型大孔樹(shù)脂對(duì)黑粒小麥麩皮色素靜態(tài)吸附率隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增大，26 h時(shí)樹(shù)脂的吸附率達(dá)到最大為51.51%，到28h時(shí)吸附率略有降低為51.44%，說(shuō)明在26 h時(shí)大孔樹(shù)脂對(duì)色素的吸附已經(jīng)達(dá)到吸附平衡。因此，在以后的大孔樹(shù)脂樹(shù)脂靜態(tài)吸附試驗(yàn)時(shí)均固定吸附時(shí)間為26 h。

2.2.2 解吸率、解吸時(shí)間的測(cè)定

圖3 AB-8型大孔樹(shù)脂對(duì)黒粒小麥麩皮色素解吸率隨時(shí)間的變化

由圖3可以看出，AB-8型大孔樹(shù)脂對(duì)黑粒小麥麩皮色素解吸率隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增大后趨于平緩，6 h時(shí)樹(shù)脂的解吸率達(dá)到最大為65.11%，之后解吸率略有降低，說(shuō)明在6 h時(shí)大孔樹(shù)脂達(dá)到解吸平衡，確定解吸時(shí)間為6 h。

2.2.3 色素溶液的pH值對(duì)吸附效果的影響

表1 AB-8型大孔樹(shù)脂對(duì)不同pH值的色素溶液的吸附率

由表1可以看出，隨著色素溶液pH值的升高，大孔樹(shù)脂對(duì)色素的吸附率整體呈下降趨勢(shì)，但是總體相差不大，說(shuō)明吸附效果接近，色素溶液的pH值對(duì)樹(shù)脂的吸附率影響不大。由于色素提取液的最佳提取pH值為1.0，因此選擇pH值1.0為大孔樹(shù)脂的最適吸附pH值。

2.2.4 最佳洗脫劑乙醇濃度的選擇

圖4 大孔樹(shù)脂在不同乙醇濃度下對(duì)色素溶液的解吸率

由圖4可以看出，隨著乙醇濃度的增大解吸率先增大后趨于平穩(wěn)，這是因?yàn)椴煌瑵舛热芤旱臉O性對(duì)色素的溶解不同，對(duì)解吸產(chǎn)生影響。乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、80%、90%的顯著性差異不明顯，所以選擇pH值1.0的70%的乙醇水溶液為色素的最佳洗脫劑。

通過(guò)AB-8型大孔樹(shù)脂對(duì)黑粒小麥麩皮色素的靜態(tài)吸附試驗(yàn)確定了大孔樹(shù)脂的吸附時(shí)間為26 h，解吸時(shí)間為6 h，采用吸附的色素溶液pH值為1.0，洗脫劑為70%的酸化乙醇溶液。在此條件下測(cè)定大孔樹(shù)脂對(duì)色素溶液的最大吸附率為83.00%，最大解吸率為85.53%，這說(shuō)明AB-8型大孔樹(shù)脂可以很好對(duì)黑粒小麥麩皮色素進(jìn)行吸附與解吸，達(dá)到純化色素的目的。

2.2.5 大孔樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)

黑粒小麥麩皮色素通過(guò)AB-8型大孔樹(shù)脂柱層析柱動(dòng)態(tài)吸附，純化出來(lái)的色素的色價(jià)E1%1cm=40.89，色價(jià)比粗提物提高了9.13倍。通過(guò)大孔樹(shù)脂純化的色素提取液透明澄清，放置多天不會(huì)出現(xiàn)多糖、酸等的沉淀物，但是大孔樹(shù)脂只能對(duì)麩皮色素提取液進(jìn)行純化，并不能將其中的化合物分離開(kāi)，對(duì)其中的組成成分的分析需要進(jìn)一步研究。

2.3 高效液相色譜法對(duì)大孔樹(shù)脂純化后麩皮色素的初步分離鑒定

本實(shí)驗(yàn)利用HPLC-DAD對(duì)大孔樹(shù)脂純化后的黑粒小麥麩皮色素進(jìn)行了檢測(cè)分析，光電二極管陣列檢測(cè)器200～800 nm波長(zhǎng)范圍掃描分析。由圖5的HPLC色譜圖中可以看出分離出4個(gè)主要的色譜峰，按照出峰時(shí)間檢測(cè)的4個(gè)色譜峰的吸收峰分別為:7.241 min(276 nm/347 nm/526 nm)、7.652 min(277 nm/347 nm/527 nm)、8.142min(282 nm/327 nm/518 nm)、8.594min(282 nm/523 nm)。由圖6分析分離出的4個(gè)色譜峰的紫外吸收光譜顯示出這些化合物均在275 nm和520 nm左右的2個(gè)波長(zhǎng)處有吸收峰，這是花色苷類(lèi)化合物的特征吸收峰，因此確定為花色苷類(lèi)物質(zhì)。根據(jù)花色苷在330 nm左右有無(wú)吸收峰可以判斷該色素分子是否有酰基，由圖6可知前3個(gè)色譜峰的化合物在330 nm左右都有吸收峰，因此確定這些化合物為花色苷類(lèi)物質(zhì)且有?；Y(jié)構(gòu)，第4個(gè)為無(wú)?；Y(jié)構(gòu)的花色苷類(lèi)化合物［11－12］。

圖5 黒粒小麥麩皮色素提取物的HPLC色譜圖(525 nm)

圖6 時(shí)間7.241min(A)、7.652min(B)、8.142min(C)、8.594min(D)色譜峰處(200～800 nm)紫外全掃描圖

以上結(jié)果表明，黒粒小麥麩皮中的色素提取液中含有的物質(zhì)為多種花色苷類(lèi)化合物，利用高效液相色譜可以對(duì)花色苷進(jìn)行很好的分離，并且可以利用二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)到的紫外可見(jiàn)吸收光譜加以區(qū)分。

3 結(jié)論

通過(guò)AB-8型大孔樹(shù)脂對(duì)黑粒小麥麩皮色素的靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)，確定了大孔樹(shù)脂的吸附平衡時(shí)間為26 h，解吸時(shí)間為6 h，采用吸附的色素溶液pH值為1.0，洗脫劑為體積分?jǐn)?shù)70%的酸化乙醇溶液，AB-8型大孔樹(shù)脂對(duì)麩皮色素提取液的最大吸附率為83.00%，最大解吸率為85.53%。純化出的色素的色價(jià)E1%

1cm=40.89，色價(jià)比粗提物提高了9.13倍。利用高效液相色譜法對(duì)純化后的色素溶液分離，分離出的4個(gè)主要組分分析確定為花色苷類(lèi)化合物，其中有3個(gè)組分為花色苷類(lèi)酰基化的化合物，1個(gè)是無(wú)?；Y(jié)構(gòu)的化合物。

采用大孔樹(shù)脂純化色素具有安全無(wú)毒、處理量大、純化效果顯著等優(yōu)點(diǎn)，具備極高的工業(yè)化價(jià)值［13］。更準(zhǔn)確的色素中花色苷的結(jié)構(gòu)鑒定有待于進(jìn)一步分析，并應(yīng)用HPLC、質(zhì)譜、核磁共振等手段對(duì)色素進(jìn)行更加深入的研究。

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Identification and Purification of Pigments in Black Wheat Bran by Macroporous Resin

Li Wei1Jiang Yuan2Tang Xiao-zhen1Dong Yu-xiu1Zhang Xian-sheng1
1(College of Food Science and Engineering，Shandong Agricultural University，Taian 271018，China)
2(Shandong Science Technique Intelligence Office，Jinan 250101，China)

Studied adsorption and desorption conditions of AB-8 type macroporous resin to black wheat bran pigment，and HPLC were applied to identify the purified pigments．It was found that the absorption and desorption equilibrium time of black wheat bran in AB-8 type macroporous resin was 26 h and 7h．The affect of pH to macroporous resin adsorption rate is not significant．70%ethanol solution(pH=1.0)was used to desorption pigment．In this condition，the AB-8 macroporous resin maximum adsorption rate is 83.00% and the maximum desorption rate is 85.53%．Four main anthocyanins component was found in purified pigments．

black wheat bran，anthocyanins，macroporous resin

碩士研究生(唐曉珍副教授為通訊作者，E-mail:txz@sdau．edu．cn)。

*國(guó)家博士后基金(20100481294)，作物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題(2010KF15)，山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家科研獎(jiǎng)勵(lì)基金(BS2009NY036)，山東省博士后創(chuàng)新項(xiàng)目專(zhuān)項(xiàng)資金(200903028)，山東農(nóng)業(yè)大學(xué)青年科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目(23693)

2011－03－03，改回日期:2011－06－29