林承喜， 束長龍， 翟元娜， 林 毅， 宋福平， 張 杰＊

（1．華僑大學化工學院，廈門 361021； 2．中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193）

蘇云金芽胞桿菌（Bacill us thuringiensis，Bt）是目前世界上應用范圍最廣的殺蟲微生物，它的殺蟲活性主要來自于其在芽胞形成過程中產(chǎn)生的一種或幾種對昆蟲具有毒殺活性的晶體蛋白，即Cry蛋白，主要由cr y基因編碼［1］。

目前，對于Cry毒素作用機理分子機制仍未完全明確。為了闡明Cr y蛋白的殺蟲機理，需要從毒素蛋白結(jié)構出發(fā)。根據(jù)已解析結(jié)構的Cr y蛋白的數(shù)據(jù)來看，不同Cr y蛋白的核心片段均由3個結(jié)構域（Do mainⅠ、Do main Ⅱ和 Domain Ⅲ）組成［2］。

DomainⅠ位于毒素蛋白的N端，是一個由7個α螺旋組成的螺旋束。研究表明，DomainⅠ中心的α4－loop－α5“發(fā)卡”結(jié)構，與昆蟲中腸孔道的形成直接相關［3－5］。Satita通過替換 Cr y4 Aa 的 DomainⅠ中α4－α5 l oop上的 Cys192－Cys199和富 Pr o區(qū)Pr o193Pro Asn Pr o196發(fā)現(xiàn)α4－α5“發(fā)卡”結(jié)構對孔道的形成有重要作用［6］。Do mainⅡ由3個β－折疊片層構成 β－棱 柱 （β－pris m）結(jié) 構［4］。Fu miaki將 位 于Cry1Aa中Do mainⅡLoop上的R311、N376和G442突變?yōu)镃ys后發(fā)現(xiàn)Loop1，2，3能夠與受體類鈣黏蛋白Bt R175結(jié)合［7］。DomainⅢ由兩個彎曲的反向平行的β－折疊構成“β－三明治”結(jié)構，對它的活性區(qū)和功能還知之甚少，僅發(fā)現(xiàn)其參與決定毒素的專一性并操縱離子通道的活性，且對毒素的穩(wěn)定性非常重要［8－9］，因此極小的改變也可能引起蛋白構象明顯改變并導致活性大幅下降［10］。

cr y1Ba3基因是由本實驗室克隆的殺蟲基因［11］，其表達產(chǎn)物對小菜蛾（Pl utell a xyl ostell a）、馬鈴薯甲蟲（Leptinotarsa decemlineata）等害蟲具有毒殺作用，而且與Cr y1 Ac蛋白沒有交互抗性［12］。王廣君等研究發(fā)現(xiàn)Cry1Ba3蛋白的活性區(qū)位于第22～655位氨基酸之間，其中Loop1和Loop2對Cry1Ba3的殺小菜蛾活性有重要作用［13－14］。雖然前人已經(jīng)對Cry1Ba3的結(jié)構與功能關系進行了一些探索，但要完全闡明Cry1Ba3的殺蟲機理還需要更深入的研究。在前人研究的基礎上，本文對Cry1Ba3活性區(qū)進行完整的掃描，通過同源建模、序列比對選定了遍布于3個結(jié)構域的20個氨基酸進行定點突變，通過生物活性測定發(fā)現(xiàn)了3個活性相關的氨基酸位點，并進行了突變蛋白的結(jié)構分析比對。

1 材料與方法

1．1 菌株和質(zhì)粒

菌株與質(zhì)粒見表1。

表1 供試菌株與質(zhì)粒

續(xù)表1

1．2 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨1．0%，酵母提取物0．5%，Na Cl 1．0%，p H 7．0。

LB固體培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基添加1．3%的瓊脂。

1．3 主要試劑

蛋白Low Marker購自NEB公司，質(zhì)粒提取試劑盒購自Invitrigen公司，定點突變試劑盒Easy Mutagenesis System購自北京全式金生物技術公司。

IPTG：1．0 mol／L，水溶液，－20℃保存。

氨芐青霉素，水溶液100 mg／mL，－20℃保存。

1．4 供試昆蟲

小菜蛾（Pl utell a xylostell a）2齡幼蟲，由本實驗室提供。

1．5 Cry1Ba3蛋白序列分析及引物設計

在P?le Bio－Inf or matique Lyonnais數(shù)據(jù)庫提交Cr y1Ba3的蛋白序列，進行二級結(jié)構預測，初步確定Cr y1Ba3的主要二級結(jié)構的大致范圍；通過Bio Edit軟件對Cry1Ba3蛋白的疏水區(qū)進行分析，找到可能的作用中心。再結(jié)合Clustal W軟件將Cry1Ba3與Cry1 Aa1、Cry2Aa1、Cry3 Aa1以及Cry4Ba1進行多序列比對，在Cr y1Ba3的3個結(jié)構域內(nèi)，根據(jù)酸堿性、所帶電荷、疏水／親水、側(cè)鏈大小等特性，選取了20個可能對Cr y1Ba3殺蟲活性有所影響的氨基酸，設計合成半重疊引物，不同引物的序列及突變的位點見表2。

表2 引物及其序列

續(xù)表2

1．6 突變質(zhì)粒的構建

利用Easy Mutagenesis System試劑盒進行定點突變，獲得20個突變質(zhì)粒，突變質(zhì)粒的具體構建方法參見試劑盒說明。

1．7 突變質(zhì)粒的篩選及鑒定

將轉(zhuǎn)化子涂布在含有100μg／mL氨芐青霉素的固體LB培養(yǎng)基上，篩選陽性克隆。從獲得的陽性轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒（方法見公司試劑盒說明），經(jīng)酶切鑒定后再由上海生工生物技術公司測序：其中Ms～M7號突變體采用p ET－21b載體上的通用引物T7進行測序，M8～M18號突變體設計中間引物序列CCGACTATTGCGTAGAATGGTAT AAT ACAGGTC進行測序，L3突變體采用通用引物T7進行反向測序，測序結(jié)果用DNA MAN軟件分析。

1．8 蛋白的誘導表達與蛋白提取

將含有野生型cr y1Ba3基因和突變的cr y 1Ba3基因重組質(zhì)粒以及空白質(zhì)粒的大腸桿菌BL21菌株轉(zhuǎn)化子分別接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220 r／min活化過夜；1%接種于300 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220 r／min培養(yǎng)至A600到0．5左右；加入IPTG至終濃度為1 mmol／L，18℃、180 r／min誘導16 h。離心收集菌體，將菌體懸浮于20 mmol／L Tris－HCl（p H 8．0）緩沖液中，超聲波破碎細胞10 min（超聲功率：80%，超聲：5 s；暫停：5 s），12 000 r／min離心15 min，將沉淀重新懸浮于20 mmol／L Tris－HCl（p H 8．0）緩沖液中；采用SDS－PAGE 分析各種重組蛋白并進行定量。

1．9 生物活性測定

將提取的各種蛋白用 20 mmol／L Tris－HCl（p H 8．0）緩沖液稀釋成相應梯度后，分別進行小菜蛾生物活性測定的初篩和復篩。

初篩：將突變蛋白稀釋成100、10、1μg／mL的濃度梯度，分別以Cr y1Ba3和20 mmol／L Tris－HCl（p H 8．0）緩沖液為陽性對照和陰性對照。將甘藍葉片用打孔器切割成直徑6 c m的圓片，分別在不同梯度的蛋白稀釋液中浸泡10 s，每個梯度做3個重復。室溫晾干后每片菜葉接上15頭2齡小菜蛾幼蟲，置于26℃恒溫培養(yǎng)箱中，48 h后檢查活蟲數(shù)。

復篩：根據(jù)初篩的結(jié)果估算出各突變蛋白對小菜蛾的LC50區(qū)間，如在10μg／mL以上則將突變蛋白稀釋為200、150、100、75、50、32．5、25、16．5、12．5μg／mL梯度，按照初篩的方法進行復篩，并用POLO軟件計算測試蛋白的LC50；如果根據(jù)初篩估算的LC50在10μg／mL以內(nèi)，則將待測蛋白稀釋為12．8、6．4、3．2、1．6、0．8、0．4、0．2、0．1、0．05μg／mL，具體步驟參見文獻［13］。

1．10 突變蛋白二級結(jié)構分析

將突變蛋白的氨基酸序列提交到P?le Bio－Infor matique Lyonnais網(wǎng)站的NPS＠數(shù)據(jù)庫進行SOPMA二級結(jié)構預測。得到數(shù)據(jù)后，進行比對分析，找到變化明顯的二級結(jié)構區(qū)域。

2 結(jié)果與分析

2．1 Cry1Ba3三維結(jié)構的模擬與序列分析

2．1．1 Cry1Ba3二級結(jié)構的預測

在P?le Bio－Inf or matique Lyonnais數(shù)據(jù)庫提交Cr y1Ba3的蛋白序列，進行二級結(jié)構預測，Cr y1Ba3的二級結(jié)構如圖1。從圖1可以看出，Cry1Ba3的第250位氨基酸以前多為α－螺旋，其中α－4螺旋特別長；250～450應該是Do mainⅡ的大致范圍，該范圍主要是β－折疊組成和Loop；而450～650應該是DomainⅢ的大致范圍，該范圍的主要組成部分也是β－折疊和Loop。上述的分析結(jié)果表明Cry1Ba3的二級結(jié)構與已解析結(jié)構的蛋白基本一致，因此突變位點的選擇可以一定程度上參考其他Cry蛋白的研究成果。

圖1 Cr y1Ba3的二級結(jié)構

2．1．2 Cry1Ba3的疏水區(qū)分析

利用Bio Edit軟件對Cr y1Ba3蛋白的疏水區(qū)進行分析，分析結(jié)果如圖2。從圖2可以發(fā)現(xiàn)在60～80、260～263、397～404 3個片段的疏水性比較異常：蛋白活性區(qū)疏水值均為負數(shù)，只有這3個區(qū)域數(shù)值均大于0。也就是說整個蛋白是親水的，而上述3個片段是疏水的，因此在三級結(jié)構水平，這3個區(qū)域應該是互相靠近，且位于整個結(jié)構的內(nèi)側(cè)，這有利于與毒素受體特異性結(jié)合，結(jié)合氨基酸的分子特點設計了3個突變：M16（W399 A）、M17（G400 A）和 M18（Y402 A）。

2．1．3 多序列比對

利用Cl ustal W軟件將Cr y1Ba3與Cr y1 Aa1、Cry2Aa1、Cry3 Aa1以及Cr y4Ba1進行多序列比對。結(jié)合二級結(jié)構分析的結(jié)果，在Cr y1Ba3的3個結(jié)構域內(nèi)，根據(jù)酸堿性、所帶電荷、疏水／親水、側(cè)鏈大小等特性，又選取了17個氨基酸進行定點突變：Ms（C35 A）、M1（R87 A）、M3（R118C）、M4（A168R）、M5（H187F）、M6（R192L）、M7（F201 A）、M8（R247 A）、M9（D254A）、M10（W303 A）、M11（S317 A）、M12（W340 A）、M13（S341 A）、M14（T343 A）、M15（R344 A）、M19（H485 G）。

圖2 Cry1Ba3蛋白的疏水區(qū)分析

2．1．4 突變質(zhì)粒的構建

定點突變獲得了20個突變質(zhì)粒，經(jīng)過轉(zhuǎn)化大腸桿菌J M110，酶切鑒定證明基因片段準確無誤，經(jīng)序列測定結(jié)果表明所有突變位點均突變正確。

2．2 突變蛋白的誘導表達和SDS－PAGE檢測

將重組質(zhì)粒及空質(zhì)粒導入大腸桿菌BL21，IPTG誘導表達后，進行SDS－PAGE檢測，結(jié)果表明這些突變基因能正常表達，且目標蛋白（65 ku左右）主要以包涵體的形式存在沉淀中，結(jié)果如圖3。

圖3 重組蛋白的SDS－PAGE檢測

2．3 突變蛋白生物活性測定結(jié)果

殺蟲測定結(jié)果如表3所示。從表3可以看出：Ms～M5、M7～M9、M11～M18這17個突變蛋白的殺小菜蛾活性沒有明顯的變化；突變蛋白 M6：192位的Ar g替換為Leu后獲得的突變蛋白對小菜蛾的殺蟲活性明顯降低，蛋白濃度提升到200μg／mL，也沒有明顯的殺蟲活性；突變蛋白M10（W303 A）和M19（H485G）的殺蟲活性也降低明顯，LC50分別為56．4μg／mL和51．0μg／mL，是Cr y1Ba3的49倍和44倍。利用軟件SPSS對生測數(shù)據(jù)進行LSD分析，結(jié)果如表3，標注不同小寫字母的表示差異顯著（p＜0．05）。

表3 突變蛋白的生測結(jié)果1）

2．4 突變蛋白二級結(jié)構預測

突變蛋白二級結(jié)構預測結(jié)果與野生型蛋白進行對比，將明顯改變的區(qū)域用黑三角形標明，如圖4（活性無明顯變化的突變僅部分展示）。

圖4 突變蛋白二級結(jié)構預測

從對比圖中可以看出：二級結(jié)構（如圖4中Ms、M1、M2）與野生型Cry1Ba3蛋白相比沒有明顯的變化，這個結(jié)果與殺蟲活性測定結(jié)果相吻合；M6（DomainⅠ）精氨酸被亮氨酸取代（R192L），導致第260位的β－轉(zhuǎn)角缺失，并使DomainⅢ多出一個β－折疊，這種結(jié)構上的變化很可能是造成該突變蛋白活性喪失殆盡的重要原因；M10（DomainⅡ）中色氨酸被丙氨酸替代（W303A），對突變蛋白的結(jié)構影響很大，首先缺失了核心片段的第1個α－螺旋和260位的β－轉(zhuǎn)角，同時在DomainⅢ增加了2個β－轉(zhuǎn)角；這種變化可能是該突變體活性下降49倍的原因；M19（DomainⅢ）中組氨酸突變?yōu)楦拾彼幔℉485G），對整體結(jié)構的改變較小，比較明顯的改變是使DomainⅡ的一個β－折疊發(fā)生了后移。這個細小的變化很可能導致了毒素活性下降44倍。

3 討論

本文利用同源建模、疏水區(qū)的分析以及多序列比對等方法對Cr y1Ba3進行了理化分析，并結(jié)合國內(nèi)外相關研究的成果，確定了20個突變位點。通過對突變蛋白殺小菜蛾生物活性的測定，發(fā)現(xiàn) Ms、M1、M2、M3、M4、M5、M7、M8、M9、M11、M12、M13、M14、M15、M16、M17、M18這17個突變蛋白的毒力沒有明顯變化，二級結(jié)構預測的結(jié)果表明，這些突變的二級結(jié)構與野生型蛋白相比沒有明顯變化，推測活性沒有明顯變化可能的原因是：有些氨基酸雖然對蛋白活性也有一定影響，但是往往需要多個氨基酸相互作用共同產(chǎn)生影響，因此單突變得到的一些突變體活性往往沒有明顯變化，這也是生物體應對自然選擇的一種保護措施。而突變M6、M10、M19這3個關鍵位點的氨基酸突變后活性急劇降低。Masson等研究結(jié)果表明，Cr y1類蛋白的R254是非常保守的，能夠與位于β17～β18之間的R522相互作用，與結(jié)合膜滲透性有關［15］。本文通過多序列比對，發(fā)現(xiàn)Cr y1Ba3的192位的Ar g也非常保守，突變?yōu)長eu后，M6的活性幾乎完全喪失。經(jīng)二級結(jié)構預測后，發(fā)現(xiàn)用Leu替換R192也會導致250位β－轉(zhuǎn)角缺失和β17～β18之間多出一個β－折疊。這一結(jié)果與Masson等的研究結(jié)果相符合。此外，Leu與Ar g的側(cè)鏈極為相似，但是不帶電荷，因此功能上的差別在于不能形成氫鍵。綜上，推斷Cr y1Ba3中的R192很可能也參與上述的相互作用中，且這種作用是通過Arg之間形成氫鍵來實現(xiàn)的。二級結(jié)構預測結(jié)果表明，上述這種作用的最終目的可能是為了維持Do mainⅡ的β－轉(zhuǎn)角和DomainⅢ的特定結(jié)構。

Boonhiang等將Cyt2 Aa2的132、154位和157位的Tr p替換為結(jié)構相似的Phe后，發(fā)現(xiàn)毒素失去活性，根據(jù)Schiffer等人的觀點推測可能是因為Trp殘基能促進蛋白的某些部分通過膜［16］。本文用Ala替代303位的Tr p而獲得的M10，對小菜蛾的生物活性大幅下降，這可能是因為Trp的側(cè)鏈含有吲哚基，能夠在肽鏈折疊的過程中形成氫鍵，這些由多個氨基酸側(cè)鏈相互形成的氫鍵正如一條鎖鏈，牢牢束縛住這個肽鏈，并且由于空間位阻的存在，從而使肽鏈折疊成對害蟲有活性的不規(guī)則形狀。所以，如果替換為Phe和Ala等氨基酸后，就失去了這種形成氫鍵的能力，從而影響了毒素的折疊，進而可能會影響到與受體的結(jié)合。如果要證明這種推論，尚需將活性降低的突變體再突變?yōu)閭?cè)鏈結(jié)構與Trp相似且能形成氫鍵的氨基酸，研究其活性能否恢復，這些工作將在今后開展。

此外，將位于Do mainⅢ的H485替換為最簡單的氨基酸Ala，這主要改變了DomainⅡ后半段的β－折疊和Loop的位置。目前的研究已經(jīng)證明Do mainⅡ的Loop對Cr y1類蛋白的受體識別有重要作用，因此突變蛋白的殺蟲活性會明顯降低。His屬于雜環(huán)氨基酸，側(cè)鏈的咪唑基解離常數(shù)為6．0，供出質(zhì)子和接受質(zhì)子的速度十分快且速度幾乎相等。因此，組氨酸殘基在活性蛋白中常為活性中心［17］。H485對Cry1Ba3殺蟲活性的影響應該是借助本身結(jié)構的特殊性從而決定毒素的專一性并操縱離子通道的活性，因此His很難被其他氨基酸所替代。

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