吳伯智， 謝 珣， 趙冬芹， 蔡昭林， 楊美燕， 李楚華

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東省植物發(fā)育生物工程重點實驗室，廣東廣州 510631)

遠(yuǎn)志(PolygalatenuifoliaWilld)是一種常見中藥，有安神益智、祛痰、消腫等功效[1].遠(yuǎn)志皂苷(polygala tenuigenin)系遠(yuǎn)志的主要有效成分之一.本實驗室前期工作觀察了以遠(yuǎn)志、五味子為主要配方的益智Ⅱ號對小鼠突觸結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)益智Ⅱ號能使突觸功能增強(qiáng)，軸棘穿孔突觸增多[2]；益智Ⅱ號和遠(yuǎn)志提取物均能延長小鼠的記憶，延緩記憶的消退[3].遠(yuǎn)志皂苷能提高去卵巢動物的學(xué)習(xí)記憶能力，并增加NOS陽性神經(jīng)元的表達(dá)[4].上述資料均顯示遠(yuǎn)志及遠(yuǎn)志皂苷能改善動物的學(xué)習(xí)記憶功能.關(guān)于遠(yuǎn)志皂苷提高學(xué)習(xí)記憶能力的相關(guān)機(jī)制，可能與抑制腦內(nèi)膽堿酯酶活性有關(guān)[5-7]，然而在海馬CA3突觸形態(tài)方面，卻未見有文獻(xiàn)報道.而突觸形態(tài)的可塑性是腦高級功能，尤其是學(xué)習(xí)記憶的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ).本實驗通過迷宮訓(xùn)練觀察遠(yuǎn)志皂苷對小鼠行為習(xí)得的影響，并從突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)方面探討遠(yuǎn)志皂苷的作用機(jī)制，為遠(yuǎn)志皂苷的開發(fā)應(yīng)用提供實驗依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

實驗動物為2月齡昆明品系雄性小鼠，清潔級，30只，體質(zhì)量22±2 g，由中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供(許可證號為SCXK(粵)2004-0011)，隨機(jī)分為對照組和遠(yuǎn)志皂苷組.根據(jù)分組情況，遠(yuǎn)志皂苷組每只小鼠灌胃生藥劑量為4.50 g/kg的遠(yuǎn)志皂苷溶液，對照組動物則灌胃等劑量的生理鹽水，持續(xù)24 d.給藥14 d后進(jìn)行行為學(xué)訓(xùn)練，訓(xùn)練結(jié)束后，每組隨機(jī)各取7只小鼠進(jìn)行突觸形態(tài)觀察.

小鼠飼養(yǎng)環(huán)境溫度為25±1℃，自然光照，給予充足的飲水和攝食.根據(jù)劉友平等[8]的方法改進(jìn)遠(yuǎn)志皂苷制備，其純度為87.48%，由廣東藥學(xué)院鑒定.

1.2 行為訓(xùn)練

訓(xùn)練模型為三等分輻射式迷宮箱.檢測指標(biāo)為每實驗日的正確反應(yīng)率及達(dá)學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)所需的訓(xùn)練次數(shù).采用固定次數(shù)隨機(jī)不休息法：安全區(qū)以無規(guī)則的順序變換.小鼠受電擊后從起步區(qū)直接到安全區(qū)為“正確反應(yīng)”，反之為“錯誤反應(yīng)”.小鼠每天訓(xùn)練10次，2次訓(xùn)練時間間隔為20～30 s.當(dāng)正確反應(yīng)率≥90%時，表明動物達(dá)到學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)(達(dá)標(biāo)).電擊強(qiáng)度為25～50 V，所有行為訓(xùn)練均在晚間暗條件安靜環(huán)境中進(jìn)行.

1.3 電鏡觀察

1.3.1 樣品的制備 取腦固定.按透射電鏡常規(guī)制樣方法處理組織塊，EPON812包埋，LKB超薄切片機(jī)切片，檸檬酸鉛和醋酸鈾雙染色，Hitach 7500透射電鏡下觀察切片.

1.3.2 指標(biāo)測試 在電鏡下選擇Gray-I型興奮突觸拍片.每個樣品隨機(jī)選取4～6張電鏡照片，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行測量和統(tǒng)計.突觸活性帶長度的測定按羅蘭等(1990)的方法(圖1)進(jìn)行.突觸間隙采用多值平均法，突觸數(shù)密度(PSD)與穿孔突觸比例統(tǒng)計：突觸計數(shù)依據(jù)JONES等(1991)所確定的標(biāo)準(zhǔn).立體學(xué)方法定量分析突觸的數(shù)密度(Nv)，所用公式為：Nv=8ENa·(π2)-1(Na為單位面積中的突觸數(shù)量，E為PSD長度倒數(shù)的平均值).

圖1 突觸活性帶和PSDFigure 1 Synaptic active zone and postsynaptic density

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2 結(jié)果與分析

2.1 遠(yuǎn)志皂苷對小鼠行為習(xí)得的影響

2.1.1 對小鼠每日行為訓(xùn)練正確反應(yīng)率的影響 表1所示，行為訓(xùn)練使各組小鼠每天的正確反應(yīng)率均逐漸升高.遠(yuǎn)志皂苷組的正確反應(yīng)率均高于相應(yīng)的對照組；訓(xùn)練第4～8天，遠(yuǎn)志皂苷組小鼠的正確反應(yīng)率顯著高于對照組小鼠(P<0.05)；第7天遠(yuǎn)志皂苷組小鼠已達(dá)學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)，而對照組小鼠直至第9天才達(dá)學(xué)會標(biāo)準(zhǔn).第9～10天2組小鼠均已達(dá)學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)，2組小鼠在正確反應(yīng)率上沒有顯著性差異.

2.1.2 對小鼠行為達(dá)標(biāo)所需訓(xùn)練次數(shù)的影響 圖2所示，經(jīng)過10 d的行為訓(xùn)練，所有小鼠均達(dá)學(xué)會標(biāo)準(zhǔn).遠(yuǎn)志皂苷組小鼠達(dá)標(biāo)所需的訓(xùn)練次數(shù)為68.70±18.72，明顯低于對照組的89.30±17.59(P<0.05).

表1遠(yuǎn)志皂苷對小鼠正確反應(yīng)率的影響(n=15) %
Table 1 Effect of polygala tenuigenin on the correct response rate in mice(n=15)

DayControlPolygala tenuigenin153.00±15.6763.00±15.67264.00±15.7868.00±15.49371.00±11.9773.00±13.37473.00±17.6785.00±9.72a576.00±18.3888.00±11.97a675.00±9.7289.00±11.74b783.00±14.1893.00±18.28a884.00±17.7695.00±5.27a992.00±11.3595.00±8.501091.00±15.2497.00±5.27

注：a:P<0.05，b:P<0.01(下同)

圖2 遠(yuǎn)志皂苷對小鼠行為達(dá)標(biāo)所需訓(xùn)練次數(shù)的影響(n=15)Figure 2 Effect of polygala tenuigenin on the training number of reaching standard in mice (n=15)

2.2 遠(yuǎn)志皂苷對小鼠海馬CA3區(qū)突觸形態(tài)的影響

表2和圖3～圖7所示.在相同視野下，遠(yuǎn)志皂苷組小鼠海馬CA3區(qū)突觸數(shù)密度增大(P<0.01)，穿孔突觸增加(P<0.05)，以不對稱突觸為主.與對照組比較，奕融活性帶增長(P<0.05)，突觸間隙變窄(P<0.01)，PSD明顯增厚(P<0.01).顯示遠(yuǎn)志皂苷能影響海馬CA3區(qū)突觸數(shù)目與相關(guān)的形態(tài)特征.

表2遠(yuǎn)志皂苷對小鼠海馬CA3區(qū)突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響(n=30)
Table 2 Effect of polygala tenuigenin on synaptic morphology of hippocampal CA3in mice(n=30)

ItemsControlPolygala tenuigeninLength of active zone/nm200.41±38.26223.68±42.40aWidth of synaptic clef/nm13.32±1.8310.90±1.10bThickness of PSD/nm51.65±11.2658.97±8.02bNv of synapses/(N·(μm3)-1)0.79±0.100.98±0.11bPercentage of perforated synapses/%3.705.26a

圖3 遠(yuǎn)志皂苷對小鼠海馬CA3區(qū)突觸數(shù)量的影響(×20 000)Figure 3 Effect of polygala tenuigenin on synaptic density of hippocampal CA3 in mice (×20 000) 注：箭頭所指為突觸

圖4 遠(yuǎn)志皂苷對小鼠海馬CA3區(qū)穿孔突觸的影響(×20 000)Figure 4 Effect of polygala tenuigenin on perforated synapses of hippocampal CA3 in mice (×20 000) 注：箭頭所指為穿孔突觸

圖5 遠(yuǎn)志皂苷對小鼠海馬CA3區(qū)PSD厚度的影響(×70 000)Figure 5 Effect of polygala tenuigenin on PSD of hippocampal CA3 in mice (×70 000) 注：箭頭所指為PSD

圖6 遠(yuǎn)志皂苷對小鼠海馬CA3突觸間隙寬度的影響(×70 000)Figure 6 Effect of polygala tenuigenin on synaptic clef of hippocampal CA3 in mice (×70 000) 注：箭頭所指為突觸間隙

圖7 遠(yuǎn)志皂苷對小鼠海馬CA3突觸活性帶長的影響(×70 000)Figure 7 Effect of polygala tenuigenin on active belt length of hippocampal CA3 in mice (×70 000) 注：箭頭所指為突觸活性帶

3 討論

根據(jù)前期工作的結(jié)果[4]確定了2.25、4.50、9.00 g/kg的生藥劑量，連續(xù)給小鼠進(jìn)藥24 d.以劑量為4.50 g/kg的生藥質(zhì)量分?jǐn)?shù)益智效果最為明顯，因此本實驗選擇4.50 g/kg為用藥質(zhì)量分?jǐn)?shù).

3.1 遠(yuǎn)志皂苷對小鼠行為習(xí)得的影響

遠(yuǎn)志皂苷對小鼠的行為習(xí)得具有明顯的提高作用.張耀春等[9]發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)志提取物均能不同程度提高東莨菪堿、亞硝酸鈉、電休克和自然衰老所致的學(xué)習(xí)記憶障礙模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能.金國琴等[10]研究調(diào)心方(主藥包括黨參、遠(yuǎn)志、桂枝等)防治阿爾茨海默病(AD)的作用，指出藥能有效改善AD大鼠空間學(xué)習(xí)記憶障礙.研究表明，遠(yuǎn)志皂苷能夠通過抑制β分泌酶的活性，抑制體外培養(yǎng)的成神經(jīng)細(xì)胞分泌Aβ[11]；遠(yuǎn)志皂苷對丙酮醛誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性表現(xiàn)出抗細(xì)胞凋亡和抗氧化性，抑制丙酮醛誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡蛋白酶的活性、清除細(xì)胞內(nèi)活性氧簇[12].在本研究中，遠(yuǎn)志皂苷提高小鼠的學(xué)習(xí)能力是否與其抗凋亡或抗氧化相關(guān)，有待進(jìn)一步的探討.此外，有文獻(xiàn)報道，遠(yuǎn)志皂苷可使Aβ1～40模型皮層神經(jīng)元突起數(shù)目明顯增多、神經(jīng)元突起長度明顯伸展[13].一般認(rèn)為，行為的可塑性與突觸的可塑性密切相關(guān).而突觸可塑性包括突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化.那么，遠(yuǎn)志皂苷對學(xué)習(xí)記憶的促進(jìn)作用是否與突觸形態(tài)的改變有關(guān)？由于遠(yuǎn)志皂苷對突觸形態(tài)的影響尚未見有報道，因此本研究在行為學(xué)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究遠(yuǎn)志皂苷對突觸形態(tài)的影響.

3.2 遠(yuǎn)志皂苷對小鼠海馬突觸形態(tài)的影響

海馬在情緒、學(xué)習(xí)和記憶活動中具有重要作用.海馬結(jié)構(gòu)內(nèi)部聯(lián)系主要是三突觸環(huán)路，而CA3區(qū)在學(xué)習(xí)與記憶中起著重要作用，這是本實驗選擇觀察海馬CA3區(qū)突觸形態(tài)的依據(jù).

本實驗結(jié)果表明：遠(yuǎn)志皂苷能使小鼠海馬CA3區(qū)的突觸密度顯著增大，穿孔突觸增加，活性帶增長，突觸間隙變窄，PSD明顯增厚.

GEINISMAN等發(fā)現(xiàn)老年大鼠的海馬齒狀回穿孔突觸顯著減少.突觸穿孔現(xiàn)象可能是突觸分裂的中間步驟，突觸穿孔后PSD 變?yōu)楣?jié)段性，出現(xiàn)多個活性區(qū)，使得不同受體簇的不同活性區(qū)傳遞功能大大加強(qiáng)，進(jìn)一步增強(qiáng)了突觸傳遞功效.也有人認(rèn)為穿孔現(xiàn)象常出現(xiàn)于結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大突觸中，而且各種刺激會使小突觸變大[14].總之，突觸穿孔現(xiàn)象與突觸的功能狀態(tài)有關(guān)，功能越復(fù)雜的腦區(qū)，穿孔突觸的比例越多，是突觸可塑性的重要表現(xiàn)之一.研究發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)志提取物可以使體外培養(yǎng)的神經(jīng)元軸突增長[15].那么，遠(yuǎn)志皂苷是否也可促進(jìn)在體小鼠神經(jīng)元軸突的增長？另有報道指出，遠(yuǎn)志皂苷可促進(jìn)CA1區(qū)神經(jīng)元干細(xì)胞的增殖[16].那么，遠(yuǎn)志皂苷對CA3區(qū)神經(jīng)元的增殖或凋亡是否有影響？其影響是否與突觸可塑性有關(guān)？仍有待研究.

ZIFF認(rèn)為PSD 在突觸后的發(fā)育及功能活動依賴區(qū)的可塑性中有重要意義[17].環(huán)境因素的刺激，如藥物、訓(xùn)練等可引起腦部不同區(qū)域的PSD 厚度的變化.而突觸間隙寬度的增大，可使遞質(zhì)到達(dá)突觸后膜的時間延長，增加遞質(zhì)失活的機(jī)會，從而使突觸傳遞的效率下降.在本實驗中，遠(yuǎn)志皂苷使海馬神經(jīng)元PSD厚度明顯提高，突觸活性帶增長，這些變化必將促進(jìn)PSD的生化反應(yīng)及突觸傳遞效率，提高小鼠的學(xué)習(xí)能力.而突觸間隙寬度卻明顯變小，有利于神經(jīng)遞質(zhì)的有效傳遞.

綜上所述，遠(yuǎn)志皂苷能明顯提高小鼠的學(xué)習(xí)能力.此外，遠(yuǎn)志皂苷還能使突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生相應(yīng)的變化.從而推測遠(yuǎn)志皂苷可能通過改變突觸可塑性而起益智作用.

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