牛廣華 高玉潔 高明利 郭 鶴 王柏山 (遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，沈陽 110032)

類風濕關節(jié)炎(Rheumatoid arthrits，RA)作為一種發(fā)病機理不同，治療效果不佳，致殘率很高的自身免疫性疾病，至今無滿意的治療藥物，傳統的慢作用抗風濕藥副作用大，患者耐受性差，新型的生物制劑費用昂貴，不能口服，體內清除快，靶向性差，而骨髓間充質干細胞移植治療從理論上可克服以上缺陷，是一種新的非常有前途的治療手段。

骨髓間充質干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是一種存在于骨髓中的非造血干細胞，具有自我更新、高度增殖及多向分化的能力。隨著對BMSCs研究的不斷深入，BMSCs自體或異體骨髓移植已經證實在治療自身免疫病中有確切的療效，并已成為治療自身免疫病的一種新的趨勢。

基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMPs)在RA關節(jié)骨及軟骨的破壞中發(fā)揮重要作用[1]。RA患者滑液及滑膜細胞均有MMPs的高表達[2]。MMP-2、MMP-9與RA的病情嚴重程度及關節(jié)破壞相關，MMP-2、MMP-9是明膠酶，其作用的底物是關節(jié)軟骨的重要組成成分。動物實驗也證實，MMP-2、MMP-9與RA的病情嚴重程度及關節(jié)破壞相關。

為此本項目通過BMSCs移植治療小鼠Ⅱ型膠原性關節(jié)炎(CIA)的實驗研究，觀察BMSCs治療膠原鼠組織中MMP-2及MMP-9表達的影響，并進一步探討B(tài)MSCs影響MMP表達的調節(jié)機制，為BMSCs治療人類RA提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑及藥物 ①牛Ⅱ型膠原(collagen from bovine nasal septutm，C7809，5 mg，Sigma 公司);②弗氏完全佐劑(Fveunds complete adjuvant，098K8729-CAS 9007-81-2，10 ml，Sigma公司);③流式細胞儀抗體 PE-CD34，FITC標記的小鼠抗體(Pharmingen公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 BMSCs的體外分離和表型鑒定 ①以健康C57BL/6(H-2b)小鼠為供體，股骨、脛骨離斷，自骨髓腔內獲取骨髓標本，收集骨髓標本5份，按2∶1的比例加入Ficoll-Hypaque分離液(密度1.077)中，并采用梯度密度離心法分離單個核細胞，用PBS液洗滌3～4遍，用1 ml生理鹽水重懸。②干細胞分選:應用美國BD公司FAcscaliburTM型分選式細胞分析儀;進行骨髓的 CD44+細胞分選。收集分選的CD44+陽性細胞，PBS充分洗滌后，以生理鹽水重懸，并調整成濃度為2×106ml-1的細胞懸液。處理完畢的采集物通過低溫凍存以備回輸。③BMSCs鑒定:流式細胞術檢測BMSCs表面抗原，BMSCs高表達 CD29、CD44、CD71，而 CD34、CD45 陰性。分別取100 μl細胞與抗鼠 CD45、CD44、CD105、CD71 抗體在室溫下充分反應30分鐘，用PBS洗滌2次，重懸于PBS液中，流式細胞儀測定其表型。確定所分離的BMSCs的純度(具體操作按試劑說明書進行)，用system 11軟件分析結果。每個樣本至少分析10 000個細胞。

1.2.2 實驗分組 近交系C57BL/6(H-2b)小鼠40只，動物年齡45～50天，體重(17±3)克，隨機分為:正常對照組、模型組、甲氨喋呤治療陽性對照組、BMSCs移植治療組，每組10只小鼠。

1.2.3 建立CIA動物模型 除正常組外，寒冷刺激10天后，將10 mg牛Ⅱ型膠原(BⅡC)與5 ml弗氏完全佐劑研磨后，以每只100 μl于小鼠背部、踝部、尾根部皮內注射免疫，免疫注射14天按上述方法少量再次腹腔內注射，作為激發(fā)注射免疫。之后對各組大鼠的發(fā)病情況進行觀察。主要為關節(jié)水腫，皮膚紅斑及關節(jié)活動情況等。第15天開始移植治療，于42天對各組小鼠的膝及肘以下關節(jié)進行組織病理學分析。

1.2.4 BMSCs(輸注)途徑及劑量 均采用尾靜脈注射途徑:CIA小鼠二次免疫接種后第2天，除模型組、正常對照組用生理鹽水，余以2×106細胞數/kg體重的密度將BMSCs注入小鼠尾靜脈內。

1.2.5 甲氨喋呤(輸注)途徑及劑量 采用每次甲氨蝶呤0.017 5 g/kg對甲氨喋呤陽性治療對照組小鼠進行灌胃，每5天一次，直到實驗倒數第2天。42天后將小鼠處死取材。

1.2.6 實驗場所 遼寧中醫(yī)藥大學動物實驗中心、遼寧中醫(yī)藥大學病理技術實驗中心。

1.3 MMP-2、MMP-9 mRNA 檢測

1.3.1 取材方法 停藥后處死小鼠，解剖取腫瘤組織，完整剝離后稱重，取脾組織1 cm×0.15 cm×0.15 cm，放入凍存管，迅速投入液氮罐，用以檢測MMP-2、MMP-9 mRNA。

1.3.2 RNA提取 采用Trizol一步法RNA提取試劑盒提取脾組織總RNA，用分光光度計測定吸光度值(OD)值，并用電泳法鑒定分子完整性。

1.3.3 逆轉錄反應 采用逆轉錄酶鏈反應(RTPCR)方法。

1.3.4 PCR 擴增 10×Buffer 5 μl，25 mmol/L MgCl23 μl，2.5 mmol/L，dNTP 4 μl，引物各 1 μl，cDNA 10 μl，Taq 酶0.15 μl，加雙蒸水后總體積達50 μl，振蕩混勻。循環(huán)條件:94℃預變性2分鐘，94℃變性30秒，57℃退火30秒，72℃延伸30秒，30個循環(huán);72℃后延伸7分鐘。擴增產物在112%瓊脂糖凝膠上進行電泳，以凝膠成像系統進行半定量分析，用MMP-2、MMP-9與β-actin比值表示其相對表達水平。MMP-2引物序列:上游5'-ATGCGGAAGCCAAGATGTG-3'，下游 5'-GTCCAGGTCAGGTGTGTAAC-3'，擴增產物長度126 bp;MMP-9引物序列:上游 5'-TGAGTCCGGCAGACAATCC-3'，下游5'-CCTTATCCACGCGAATGACG-3'，擴增產物長度432 bp;β-actin引物序列:G1:5'ACCACCATGGAGAAGGCTGG 3';G2:5'CTCAGTGTAGCCCAG-GATGC 3'，擴增產物長度528 bp。

2 結果

2.1 RNA質量鑒定 所提組織總RNA經紫外分光光度計測定:OD260/OD280在1.8～2.0之間，經甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳，獲得了兩條較清晰的電泳帶，18S和28S，其中28S的量約為18S的兩倍，證實RNA的完整性(圖1)

2.2 各組MMP-2 mRNA表達水平的影響 MMP-2 mRNA的RT-PCR分析凝膠電泳結果顯示，在126 bp處呈現出一特異性條帶(見圖2)。以528 bp βactin擴增產物作為內參照進行半定量分析(圖2、表1)，由表可見CIA鼠模型組脾組織表達的MMP-2 mRNA明顯高于正常對照組、甲氨蝶呤治療組、BMSCs移植治療組(P＜0.05);而BMSCs移植治療組與甲氨蝶呤治療組有顯著性差異(P＜0.05)，與正常對照組無顯著性差異(P＞0.05)。

2.3 各組MMP-9 mRNA表達水平的影響 MMP-9 mRNA的RT-PCR分析凝膠電泳結果顯示，在432 bp處呈現出一特異性條帶(見圖3)。以528 bp βactin擴增產物作為內參照進行半定量分析(圖3、表1)，由表可見CIA模型組脾組織表達的MMP-9 mRNA明顯高與正常對照組、甲氨蝶呤治療組、BMSCs移植治療組(P＜0.05);而BMSCs移植治療組與甲氨蝶呤治療組有顯著性差異(P＜0.05)，與正常對照組無顯著性差異(P＞0.05)。

圖1 RNA質量鑒定Fig.1 RNA quality identification

2.4 各組灰度值的比較 β-actin灰度值結果顯示(見表1):BMSCs移植治療組與正常對照組無統計學差異(P＞0.05);CIA模型組小鼠與正常對照組比較有統計學差異(P＜0.05);甲氨蝶呤治療組與CIA模型組小鼠比較有統計學差異(P＜0.05);而BMSCs移植治療組與甲氨蝶呤治療組有顯著性差異(P＜0.05)。

圖2 各組組織中MMP-2 mRNA的表達結果Fig.2 The expression of MMP-2 mRNA in each organization

圖3 各組組織中MMP-9 mRNA的表達結果Fig.3 The expression of MMP-9 mRNA in each organization

表1 各基因組灰度值比β-actin灰度值(μmol/L)Tab.1 The ratio of gray value genome and β-actin(μmol/L)

3 討論

MMPs是一類含有鋅原子，其活性依賴于鈣原子的肽鏈內切酶，大都以潛酶形式分泌。MMP-2和MMP-9是其中一大類，又名明膠酶，相對分子質量分別為72 000、95 000。由于其是構成細胞外基質(Extracellular matrix，ECM)降解最重要的酶系統，參與EMC的重塑、炎癥反應、免疫應答等[1]，近幾年成為研究熱點。

MMPs對細胞外基質EMC的降解是RA患者關節(jié)破壞的必要環(huán)節(jié)[2，3]。近年發(fā)現RA患者的滑液及外周血中 MMP-2，MMP-9 水平均增高[4，5]。Uchibori等[6]對關節(jié)炎模型小鼠研究也證明 MMP-2、MMP-9在關節(jié)炎的發(fā)病中起一定作用。我們的測定表明，RA患者血清中MMP-2、MMP-9水平顯著高于健康對照，提示血清MMP-2、MMP-9水平與RA病情活動相關，在RA的骨破壞中可能起作用。Makowski等[7]揭示MMP-9與抗-雙鏈DNA呈負相關，在抗體沉積在組織期間，對監(jiān)測SLE疾病的活動非常重要。Derosa等[8]發(fā)現酶譜分析是檢查MMPs水平的精確方法，當MMPs的量高于400 pg，其活性才能被檢測，其表達量與其活性的比率為7∶1。因此，該實驗不僅用于定量檢測酶的總量，而且還可檢測酶量與活性的比例，這使得酶譜不同于 ELISA，ELISA不能分辨酶的活性和非活性形式[9]。而酶譜結果能夠反映研究對象的MMPs活性，通過研究MMPs的表達水平和活性，MMPs在RA和SLE中作用能較清楚地反映出來。在正常的人體組織中，MMPs的表達較低，但在一定的病理過程中其表達水平可升高。細胞外信號，包括細胞因子、生長因子和直接的細胞與細胞之間的接觸能瞬時刺激MMPs蛋白的合成[1]。SLE是一種自身免疫性疾病，其特征是以Th2細胞介導的體液免疫反應為主，而RA則是以Th1細胞介導的細胞免疫反應為主。鑒定為什么這兩種不同免疫反應的患者血清中MMP-2和MMP-9顯著增加的機制是非常有意義的。一種可能的解釋是:不管在RA或SLE中，免疫反應過程中核轉錄因子(NF-κB)組成式激活，上調各種細胞因子的轉錄活性，提高炎性反應的細胞因子接著刺激MMPs的表達和活性[1]。但是，這種解釋需要進一步研究?？傊?，RA和SLE患者血清中MMP-2和MMP-9的表達水平和活性顯著升高，因此MMPs蛋白在自身免疫性疾病中起一定的作用，可作為該類疾病的一種輔助檢測指標。

本研究通過RT-PCR法檢測和凝膠圖像分析結果顯示在CIA小鼠脾組織中MMP-2和MMP-9的表達明顯增加。這點與別的文獻報道一致[10]。而經過BMSCs移植治療后MMP-2和MMP-9的表達明顯下降，統計學處理有顯著性差異(P＜0.05)，從而證明BMSCs對CIA小鼠移植治療后MMP-2和MMP-9有免疫調節(jié)作用。本實驗也說明BMSCs可以通過調控MMP-2、MMP-9 mRNA表達，參與RA軟骨的病理變化過程及軟骨ECM的合成，維持軟骨ECM中膠原纖維網絡構架，可有效地治療RA，并改善其臨床癥狀，是一種很有前途的生物治療方法。

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