邵文君 郭 濤 杜彥輝 (寧夏醫(yī)科大學(xué)，銀川750004)

視神經(jīng)脊髓炎(Neuromyelitis optica，NMO)，又稱Devic病、Devic綜合征，是一種先后或同時(shí)累及視神經(jīng)和脊髓的急性或亞急性脫髓鞘疾病[1]。由于視神經(jīng)脊髓炎和多發(fā)性硬化在臨床表現(xiàn)上的某些相似處及難以及時(shí)準(zhǔn)確的診斷，關(guān)于視神經(jīng)脊髓炎是一個(gè)獨(dú)立的疾病還是多發(fā)性硬化的一種臨床亞型一直都在備受關(guān)注的爭(zhēng)議，但是越來(lái)越多的研究證據(jù)表明，NMO是一種獨(dú)立的疾病。從2004年Lennon等[2]在 NMO患者血清中發(fā)現(xiàn)了一種特異性NMO-IgG 自身抗體到 2006 年 Wingerchuk 等[3，4]把血清NMO-IgG陽(yáng)性列入NMO的診斷標(biāo)準(zhǔn)中，可見(jiàn)NMO-IgG抗體檢測(cè)對(duì)于支持診斷NMO的重要性，但是目前國(guó)內(nèi)此項(xiàng)抗體檢測(cè)手段尚不成熟，絕大多數(shù)醫(yī)院還未開(kāi)展對(duì)NMO-IgG的檢測(cè)。我們采用間接免疫熒光方法檢測(cè)NMO-IgG抗體，熟悉NMO-IgG抗體測(cè)定的過(guò)程，并觀察中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病及非脫髓鞘疾病的NMO-IgG測(cè)定結(jié)果，進(jìn)一步證實(shí)NMO-IgG抗體檢測(cè)的臨床意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 收集2010年7月～2011年10月寧夏醫(yī)科大學(xué)依據(jù) Wingerchuk等[4]有關(guān) NMO診斷標(biāo)準(zhǔn)，診斷為NMO的患者9例，均為女性，發(fā)病年齡17～31歲，病程1～6年，發(fā)病次數(shù)為2～5次;并收集同期住院的多發(fā)性硬化(Multiplesclerosis，MS)患者10例，均符合 2001年 Mcdonald診斷標(biāo)準(zhǔn)[5];NMO的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]:根據(jù)患者出現(xiàn)急性起病，雙側(cè)同時(shí)或相繼發(fā)生的視神經(jīng)炎，急性橫貫性或播散性脊髓炎的臨床表現(xiàn)，結(jié)合MRI顯示視神經(jīng)和脊髓病灶，視覺(jué)誘發(fā)電位異常，CSF-IgG指數(shù)增高和出現(xiàn)寡克隆帶等。神經(jīng)科其他疾病患者46例，其中急性脊髓炎8例，脫髓鞘性脊髓炎5例，腦脊髓炎3例，腦血管病30例。

1.2 方法

1.2.1 血清制備 取得患者或監(jiān)護(hù)人知情同意簽字后，抽取研究對(duì)象清晨空腹靜脈血標(biāo)本3～5 ml，進(jìn)行離心(轉(zhuǎn)速3 000 r/min，離心10分鐘)，取上層血清，儲(chǔ)存于-80℃冰箱備用。

1.2.2 普通成年小白鼠腦組織冰凍切片 輕柔地取出完整的成年小白鼠腦組織，無(wú)過(guò)度牽拉和破損，取小鼠腦干和小腦部分制備成10 μm的腦片，4%甲醛固定后保存于-80℃冰箱備用。

1.2.3 NMO-IgG的檢測(cè) 取出制備好的腦片，10%正常山羊血清封閉，37℃、30分鐘;用PBS漂洗三次;加血清標(biāo)本(稀釋度為1∶150)，37℃孵育1小時(shí);PBS漂洗三次;加熒光素標(biāo)記抗體FITC羊抗人IgG(抗體稀釋度為1∶100)，避光，37℃孵育30分鐘;PBS避光漂洗三次;避光DAPI染核10分鐘，PBS再漂洗三次;直接封片后盡快置于熒光顯微鏡下觀察，即間接免疫熒光法檢測(cè)各組血清NMO-IgG抗體。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。特異性=抗體檢測(cè)陰性的例數(shù)/患者組非NMO疾病譜例數(shù)×100%，敏感性=抗體檢測(cè)陽(yáng)性的例數(shù)/患者組屬NMO疾病譜例數(shù)×100%。

2 結(jié)果

對(duì)配對(duì)四格表資料進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，結(jié)果提示臨床診斷NMO及非NMO病例組患者應(yīng)用NMO-IgG定性檢測(cè)陽(yáng)性率存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。

血清AQP4抗體檢測(cè)陽(yáng)性如圖1所示，NMO與非NMO患者血清NMO-IgG抗體檢測(cè)結(jié)果如表1所示，9例 NMO患者血清 NMO-IgG陽(yáng)性 8例(88.9%);10例MS患者NMO-IgG陽(yáng)性2例(20%);神經(jīng)科其他疾病患者陽(yáng)性2例(4.3%)，其中急性脊髓炎1例，腦脊髓炎1例。其余患者AQP4抗體檢測(cè)均為陰性(見(jiàn)圖2)。NMO-IgG抗體方法診斷NMO的敏感性88.9%，特異性為91.1%。

圖1 AQP4抗體檢測(cè)陽(yáng)性(×60)Fig.1 AQP4 antibody test positive(×60)

表1 NMO-IgG檢測(cè)方法對(duì)臨床診斷的NMO及非NMO患者的四格表Tab.1 The 4 case table of NMO-IgG detection methods to NMO and not NMO patients

圖2 AQP4抗體檢測(cè)陰性(×60)Fig.2 AQP4 antibody test negative(×60)

3 討論

AQP家族是近幾年來(lái)逐漸被發(fā)現(xiàn)并認(rèn)識(shí)的一類水特異性膜內(nèi)在蛋白，在哺乳動(dòng)物組織中已發(fā)現(xiàn)13種水通道蛋白(AQP0～AQP12)[7]。迄今已在腦內(nèi)已發(fā)現(xiàn)7 種AQP，分別是 AQP1、3、4、5、8、9、11，其中水通道蛋白4(AQP4)為主要在腦組織中表達(dá)的水通道蛋白。AQP4是中樞系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)最早的水通道蛋白，廣泛分布于中樞膠質(zhì)界膜、室管膜、海馬齒狀回、下丘腦的視上核和室旁核和腦表面的軟腦膜、小腦Purkinje細(xì)胞、腦微血管的細(xì)胞表面。它是膠質(zhì)細(xì)胞與腦脊液以及血管間的水調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)運(yùn)的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[8]。

2004年NMO特異性水通道蛋白4抗體(AQP4-Ab)的發(fā)現(xiàn)，更加支持NMO是一種有別于MS的自身免疫性水通道病，NMO與MS治療及預(yù)后存在很大不同:在治療方面，NMO主張以免疫抑制劑治療為主[如:硫唑嘌呤(AZP)、米托蔥醒(Mix)、靜脈丙種球蛋白(IVIg)][9，10]。而 MS 則多主張以免疫調(diào)節(jié)治療為主[如:干擾素(IFN)、醋酸格拉太咪爾(GA)][11]。預(yù)后方面，NMO 因?yàn)榇嬖谳^高的死亡率及嚴(yán)重病殘率，故預(yù)后比MS差。因此對(duì)于NMO的鑒別診斷對(duì)其進(jìn)行合理治療是很有必要的。疾病是否處于活動(dòng)期及大劑量激素治療等對(duì)血清抗體滴度有一定影響，因此對(duì)抗體檢測(cè)結(jié)果也有一定影響，本組NMO患者有一例血清抗體檢測(cè)結(jié)果為陰性，查其血樣標(biāo)本留取時(shí)間是在使用激素治療后1周。且本組MS病人有2例及1例急性脊髓炎患者及1例腦脊髓炎患者檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，此例急性脊髓炎患者2月后再次復(fù)發(fā)而診斷為NMO，對(duì)NMO-IgG抗體檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性者給予高度重視，觀查其臨床表現(xiàn)及復(fù)發(fā)情況等。

目前抗體NMO-IgG的血清學(xué)檢測(cè)陽(yáng)性已成為NMO最新診斷標(biāo)準(zhǔn)的支持條件之一[4]。對(duì)于本組研究結(jié)果顯示，采用間接免疫熒光法初步檢測(cè)到我院神經(jīng)內(nèi)科收住的患者2010年7月～2011年10月期間NMO患者血清NMO-IgG，其診斷NMO的靈敏度為88.9%，特異度91.1%。這與國(guó)外相關(guān)報(bào)道NMO-IgG抗體檢測(cè)在診斷NMO上具有高度靈敏性及特異性相近，提示NMO-IgG可作為國(guó)內(nèi)NMO診斷的重要生物學(xué)指標(biāo)。由于本項(xiàng)NMO-IgG檢測(cè)僅是一種較粗糙的抗體定性檢測(cè)方法。該方法仍待改進(jìn)以提高抗體檢測(cè)的靈敏度。且本組實(shí)驗(yàn)測(cè)定患者血清標(biāo)本量較小，但也能說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)方法是可取的，采取更精細(xì)的實(shí)驗(yàn)方法及大量的血清標(biāo)本檢測(cè)為臨床診斷提供更準(zhǔn)確的參考標(biāo)準(zhǔn)是以后的發(fā)展方向，尤其是如果有更為便捷的試劑盒檢測(cè)，為NMO-IgG抗體的測(cè)定提供更為方便且客觀標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)平臺(tái)，如對(duì)NMO-IgG抗體進(jìn)行定量檢測(cè)，分析一定范圍的抗體量對(duì)于疾病處于某段時(shí)期的意義及臨床指導(dǎo)作用，將對(duì)NMO疾病的攻破有著更為深遠(yuǎn)的意義。因本實(shí)驗(yàn)用到小鼠腦組織，對(duì)于取材時(shí)的細(xì)微差異、血樣標(biāo)本留取時(shí)間的差異如入院未能及時(shí)留取標(biāo)本及觀測(cè)結(jié)果對(duì)于觀察者來(lái)說(shuō)有一定的主觀性等多方面因素的存在，因此檢測(cè)結(jié)果的客觀性不夠強(qiáng)，但是綜合整個(gè)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果的確有一定的意義。

在2007年 Takahashi等[12]為代表的采用人AQP4轉(zhuǎn)染細(xì)胞檢測(cè)抗人AQP4抗體，這種方法較2004年Lennon等NMO-IgG檢測(cè)方法敏感性更高。當(dāng)血清抗體滴度較低時(shí)用Lennon等所采用NMOIgG檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果可能為陰性，但采用人AQP4轉(zhuǎn)染細(xì)胞檢測(cè)法則會(huì)是陽(yáng)性結(jié)果。文獻(xiàn)表明，運(yùn)用人AQP4轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為間接免疫熒光測(cè)定的酶作用底物，抗AQP4抗體測(cè)定對(duì)NMO的敏感性分別是91%，特異性是100%[11]?？贵w測(cè)定的方法仍在提高其準(zhǔn)確性及為臨床帶來(lái)的便易及實(shí)用性，我們期待NMO-IgG的測(cè)定有更美好的未來(lái)，同時(shí)對(duì)于AQP4作為NMO自身免疫反應(yīng)攻擊的靶點(diǎn)，使NMO的免疫和病理研究進(jìn)入了一個(gè)新的階段，給NMO的治療提供了新思路，或許將來(lái)AQP4可能成為NMO藥物治療的作用靶點(diǎn)，阻斷NMO的免疫進(jìn)程，為NMO的治療開(kāi)啟一個(gè)新的領(lǐng)域。

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