劉 帥 謝基明 王玉珍 宋 亮 王 娜 李云旭 孫曉琳

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特010018)

脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS) ，是 G-菌的主要致病成分，巨噬細(xì)胞受到 LPS刺激時(shí)，可激活細(xì)胞內(nèi)p38絲裂原激活的蛋白激酶，并促使誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)等的表達(dá)，催化產(chǎn)生大量NO，參與炎癥反應(yīng)[1，2]。

NO是體內(nèi)L-精氨酸(L-arginine)在一氧化氮合酶作用下產(chǎn)生的一種結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的小分子氣體化合物，它具有十分重要的生理功能。在人體內(nèi)，NO的作用主要包括兩個(gè)方面:一是信號(hào)分子作用;二是具有細(xì)胞毒性作用，NO直接或間接地作用于細(xì)胞膜、染色體及其他細(xì)胞內(nèi)成分，引起細(xì)胞死亡或癌變的過(guò)程。此外，NO形成的自由基還能作用于細(xì)胞外基質(zhì)，引起細(xì)胞外基質(zhì)成分的改變，進(jìn)而調(diào)節(jié)血管生成[3]。

一氧化氮合酶作為NO合成的關(guān)鍵酶，其表達(dá)直接影響NO的生成。一氧化氮合酶家族有3種亞型:誘導(dǎo)型(inducible NOS，iNOS)，神經(jīng)型(neural NOS，nNOS) 及內(nèi)皮型(endothelial NOS，eNOS)。其中，iNOS通常在炎癥或腫瘤等病理?xiàng)l件下誘導(dǎo)產(chǎn)生，為Ca2+非依賴性，在細(xì)胞因子及其他細(xì)胞毒性物質(zhì)的作用下產(chǎn)生大量的NO，加重炎性反應(yīng)過(guò)程或產(chǎn)生致癌作用[3]。

Rab7是Rabs(Ras related proteins in brain)蛋白的一個(gè)成員，是一種單體形式的 GTP結(jié)合蛋白，能夠結(jié)合GTP并將GTP水解[4]。在囊泡形成、轉(zhuǎn)運(yùn)、粘附、錨定、融合等不同的運(yùn)輸階段調(diào)控囊泡的運(yùn)輸。Rab7定位在晚期內(nèi)體并調(diào)節(jié)胞吞途徑的晚期環(huán)節(jié)，它與一些受體的轉(zhuǎn)運(yùn)和溶酶體的降解有關(guān)，如血管緊張素1A受體、表皮生長(zhǎng)因子受體、神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體TrkA[5-7]。Rab7還調(diào)控晚期內(nèi)體/溶酶體的聚集和融合，也是維持核周溶酶體結(jié)構(gòu)所必須的蛋白[8]。之前有研究證明 Rab7b參與TLRs信號(hào)通路且負(fù)向調(diào)控 TLRs信號(hào)通路[9]，鑒于 Rab7b與Rab7有50%的一致性和65%的相似性，我們推測(cè)Rab7和Rab7b可能有相似的功能。

siRNA是一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默的強(qiáng)大工具。siRNA是由21～23個(gè)堿基配對(duì)形成的雙鏈，其調(diào)控的機(jī)制是通過(guò)互補(bǔ)配對(duì)而沉默相應(yīng)靶位基因的表達(dá)，siRNA識(shí)別靶序列是有高度特異性的。

本實(shí)驗(yàn)是通過(guò)在RAW264.7細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染靶向于 Rab7的 siRNA，分析 Rab7基因沉默后的RAW264.7細(xì)胞的生長(zhǎng)特性，研究Rab7基因沉默后對(duì)LPS刺激的巨噬細(xì)胞中NO/iNOS表達(dá)的影響，本研究為進(jìn)一步探索Rab7在調(diào)控TLRs信號(hào)通路中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑 小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7(購(gòu)自北京協(xié)和細(xì)胞庫(kù));胎牛血清(購(gòu)自蘭州民海生物有限公司);DMEM培養(yǎng)基(Gibco，USA);MTT、LPS(均為 Sigma公司產(chǎn)品);TRIZOL、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq酶、Real-time PCR mix(均為寶生物公司產(chǎn)品);FuGENE MD Transfection Reagent(購(gòu)自羅氏公司);NO測(cè)定試劑盒(購(gòu)自南京建成生物公司);Rab7抗體、actin抗體(均為Santa Cruz公司產(chǎn)品)。

1.2 siRNA的設(shè)計(jì)合成 從GenBank中查找小鼠Rab7基因的序列，根據(jù) siRNA的設(shè)計(jì)原則，利用Ambion公司提供的網(wǎng)上在線設(shè)計(jì)工具，設(shè)計(jì)出三對(duì)siRNA序列。經(jīng)Blast比對(duì)其特異性后，由上海吉瑪制藥有限公司合成。同時(shí)合成陰性對(duì)照N-siRNA。siRNA1:sense sequence:5'-CCAGUACAAAGCCACAAUAtt-3'，antisense sequence:5'-UAUUGUGGCUUUGUACUGGtt-3';siRNA2:sense sequence:5'-CAGAAGUGGAACUGUACAAtt-3'，antisense sequence:5'-UUGUACAGUUCCACUUCUGtt-3';siRNA3:sense sequence:5'-GUGGAACUGUACAAUGAAUtt-3'，antisense sequence:5'-AUUCAUUGUACAGUUCCACtt-3'。

1.3 RAW264.7的培養(yǎng)細(xì)胞及瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 RAW264.7細(xì)胞株混懸后接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，1～2天換液或傳代一次。將適量的RAW264.7細(xì)胞接種于相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)板(6孔板:5×105個(gè)/孔)細(xì)胞密度達(dá)到90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時(shí)將siRNA與FuGENE MD Transfection Reagen混合，充分混勻，室溫靜置15分鐘，以形成siRNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物，隨后將復(fù)合物加入待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后6～8小時(shí)換液。通過(guò)Real-time PCR和Western blot驗(yàn)證相應(yīng)的干擾效果。

1.4 MTT法檢測(cè)基因沉默對(duì)RAW264.7細(xì)胞的影響 細(xì)胞計(jì)數(shù)，將 RAW264.7細(xì)胞以相同量(1×103個(gè)/孔)接種于96孔板，設(shè)3個(gè)復(fù)孔。5～6小時(shí)貼壁后血清饑餓12小時(shí)，轉(zhuǎn)染siRNA，開(kāi)始計(jì)時(shí)，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后24、48、72小時(shí)加入 MTT(0.5 mg/ml)，37℃、5%CO2培養(yǎng) 4小時(shí)，然后每孔加入150 μl DMSO，低速振蕩10秒，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀用OD570 nm檢測(cè)。

1.5 NO含量測(cè)定 細(xì)胞計(jì)數(shù)，將正常細(xì)胞以相同量(5×105)接種于6孔板，siRNA轉(zhuǎn)染后40小時(shí)，LPS刺激6小時(shí)和12小時(shí)，吸取上清，按照NO測(cè)定試劑盒測(cè)定NO含量。

1.6 總RNA提取及iNOS表達(dá)分析 TRIZOL法提取細(xì)胞的總 RNA。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) RNA完整性，并用RNA/DNA計(jì)算器對(duì)提取RNA進(jìn)行定量。1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA。以5'-TGGAGCGAGTTGTGGATTGT-3'(sense)和5'-CTCTGCCTATCCGTC TCGTC-3'(antisense)作為 iNOS引物進(jìn)行 RT-PCR和Real-time PCR。后者通過(guò)ABI 7300(Applied Biosystems，USA) 和 SYBR RT-PCR kit分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析，P＜0.05時(shí)認(rèn)為具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 基因沉默后Rab7的表達(dá) 利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染一段陰性對(duì)照(N-siRNA)和三段干擾序列(S-1、S-2、S-3)到巨噬細(xì)胞中，通過(guò)Western blot方法檢測(cè)各段干擾序列的干擾效果，如圖1A所示，與無(wú)關(guān)干擾相比，S-3序列干擾后，Rab7的蛋白表達(dá)量明顯降低。我們又做了 Real-time PCR進(jìn)一步驗(yàn)證，如圖1B所示，S-3的干擾效果在50%。之后的實(shí)驗(yàn)就確定用S-3序列作為干擾序列。

2.2 MTT檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長(zhǎng)趨勢(shì) 我們隨后檢測(cè)了RAW264.7細(xì)胞中Rab7干擾后細(xì)胞的生長(zhǎng)特性。從MTT測(cè)定的細(xì)胞生長(zhǎng)趨勢(shì)(圖2)中可以看出，在Rab7干擾后48小時(shí)，RAW264.7的生長(zhǎng)顯著加速，到72小時(shí)時(shí)仍高于對(duì)照。

2.3 Rab7基因沉默后對(duì)LPS刺激的巨噬細(xì)胞中iNOS/NO的影響 NO因參與殺滅微生物而且介導(dǎo)一系列病理生理反應(yīng)過(guò)程而日益受到人們的關(guān)注。我們通過(guò)檢測(cè)LPS刺激Rab7基因沉默的細(xì)胞不同時(shí)間的NO分泌量，初步分析Rab7在LPS/TLR4通路中的作用。Rab7基因沉默的巨噬細(xì)胞中，NO的含量隨著LPS刺激時(shí)間增加而增加，在LPS刺激后12小時(shí)，Rab7的沉默顯著促進(jìn)了NO的生成(圖3)。

前面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Rab7基因沉默促進(jìn)了LPS介導(dǎo)的NO的產(chǎn)生。我們進(jìn)一步研究這種抑制作用是否通過(guò)抑制iNOS的活性導(dǎo)致。用LPS刺激Rab7基因沉默后的巨噬細(xì)胞不同時(shí)間，通過(guò) RTPCR檢測(cè)iNOS的含量，發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的增加，iNOS的表達(dá)量明顯增加，12小時(shí)達(dá)到最大值(圖4A)。

圖1 Rab7在siRNA干擾后的表達(dá)Fig．1 Rab7 expression after silencing

圖2 Rab7干擾后細(xì)胞的生長(zhǎng)趨勢(shì)Fig．2 The growth trend of Rab7 silenced cells

圖3 NO含量測(cè)定Fig．3 NO determination

圖4 iNOS含量測(cè)定Fig.4 iNOS determination

Real-time PCR(圖4B)的結(jié)果顯示，Rab7沉默后顯著促進(jìn)了LPS刺激的RAW264.7中iNOS的表達(dá)(P＜0.01)以上的實(shí)驗(yàn)充分說(shuō)明，Rab7基因沉默后促進(jìn)了LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO/iNOS的表達(dá)。

3 討論

內(nèi)源性NO參與了體內(nèi)眾多生理、病理過(guò)程，包括免疫調(diào)節(jié)、松弛平滑肌、神經(jīng)遞質(zhì)及細(xì)胞毒作用等[10]。NO的生成過(guò)量與炎癥發(fā)生密切相關(guān)。Poly I:C、LPS、IFN-γ、TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6、IL-12 及粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)等都能活化巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)iNOS表達(dá)及產(chǎn)生NO。NO是自由基性質(zhì)氣體，具有非常活潑的化學(xué)性質(zhì)。正常情況下，NO維持時(shí)間長(zhǎng)，具有重要的殺菌、抗病毒、殺傷腫瘤細(xì)胞等活性，但一旦失衡，就會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)自由基濃度過(guò)高及一系列自由基反應(yīng)病理性加劇而誘發(fā)疾病。

通過(guò)NO和iNOS的含量測(cè)定表明Rab7基因沉默明顯促進(jìn)了LPS介導(dǎo)的NO和iNOS的生成。之前有實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Rab7過(guò)表達(dá)質(zhì)粒明顯抑制了LPS介導(dǎo)的NO和iNOS的生成，并且Rab7失活突變基因的表達(dá)阻斷了Rab7的抑制效應(yīng)[11]。由此我們?cè)俅未_定Rab7基因負(fù)向調(diào)控NO和iNOS的生成而且依賴其GTP酶的活性。

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染干擾RNA的成功為之后進(jìn)一步研究Rab7對(duì)NO生成和Toll信號(hào)通路中的作用奠定基礎(chǔ)。同時(shí)，炎癥局部產(chǎn)生的多種細(xì)胞因子，可激活NO產(chǎn)生，NO又促進(jìn)其中的多種細(xì)胞因子合成，進(jìn)而引發(fā)瀑布式的炎癥反應(yīng)(Inflammatory cascade)，所以我們可推測(cè)Rab7基因的沉默會(huì)正向調(diào)控IFN-γ、TNF-α和白介素等炎性因子的表達(dá)，也可能正向調(diào)控TLRs的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

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