黃漢昌，姜招峰

1北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院;2北京聯(lián)合大學(xué)生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點實驗室，北京100191

蘆丁與人血清白蛋白相互作用的紫外可見光譜特性研究

黃漢昌1*，姜招峰2

1北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院;2北京聯(lián)合大學(xué)生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點實驗室，北京100191

本文通過測定蘆丁與HSA相互作用前后的紫外可見吸收光譜、圓二色性及人血清白蛋白(HSA)的熒光特性，研究了蘆丁與HSA結(jié)合作用。結(jié)果表明，蘆丁在紫外區(qū)有三個特征的吸收峰(264.0、285.5及354.5 nm)、在330～300 nm及300～230 nm處顯示圓二色性，HSA引起蘆丁紫外可見吸收光譜波峰紅移;蘆丁與HSA相互作用后，不引起HSA二級結(jié)構(gòu)的改變，但對其三級結(jié)構(gòu)有影響，同時對HSA熒光激發(fā)及發(fā)生光譜最大峰位及幅度有影響。

蘆丁;人血清白蛋白;紫外吸收;圓二色性;熒光光譜

蘆丁(Rutin)亦稱蕓香苷(Rutinoside)是黃酮類生物活性物質(zhì)，存在于70多種植物中，如煙葉、槐花、蕎麥和蒲公英等，其中以槐米和蕎麥葉的含量較高［1］。蘆丁具有降低毛細(xì)血管的異常通透性和脆性的作用，具有維持與增強(qiáng)毛細(xì)血管抵抗力，降低其通透性，促進(jìn)細(xì)胞增生和抗炎、抗過敏、利尿、降血脂等作用。臨床上用于治療毛細(xì)血管引起的出血癥，并常作為高血壓的輔助治療藥［2］。蘆丁為黃酮類物質(zhì)，由于很容易得到對照品，因此中藥或中藥制劑常以蘆丁為對照品測定總黃酮含量［3-6］。在研究中蘆丁常作為黃酮類化合物的模型化合物，研究黃酮類物質(zhì)的理化性質(zhì)及生理活性［7-11］。人血清白蛋白(Human Serum Albumin，HSA)是血漿中含量最豐富的載體蛋白，是生物活性物質(zhì)發(fā)揮生物效應(yīng)的重要載體和靶向分子。本文就蘆丁與HSA相互作用的光譜特性進(jìn)行了研究。

1 實驗材料與實驗方法

1.1 儀器與材料

圓二色光譜儀(JASCO 810，日本分光公司);紫外可見分光光度計(UV-2450，日本島津公司);熒光分光光度計(RF-301，日本島津公司)。

蘆丁，中國生物制品藥品鑒定所(Mw 610，HPLC＞97%);人血清白蛋白HSA(Mw 66000，96%～99%，MERK公司);甲醇(色譜純，北京化學(xué)試劑公司)，磷酸鉀鹽緩沖液(PBS)(pH=7.40，內(nèi)含NaC1溶液0.5 mol/L)。

1.2 實驗方法

1.2.1 紫外可見吸收光譜(UV-Vis Abs)測定

蘆丁UV-Vis Abs:精密稱取蘆丁樣品30.5 mg于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻配成0.001 mol/L(M)的蘆丁樣品儲備溶液。吸取適當(dāng)蘆丁儲備液，用水稀釋，制備1.0×10-5M，1.5× 10-5M，2.5×10-5M，5.0×10-5M的蘆丁待測樣品。分別以待測蘆丁待測樣品空白溶液為對照，測定蘆丁500～200 nm紫外可見吸收光譜。

HSA對蘆丁UV-Vis的影響:精密稱取14.0 mg HSA于10 mL的容量瓶中，磷酸鹽緩沖溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻配成2.0×10-5M的HSA儲備溶液。吸取適當(dāng)?shù)腍SA儲備溶液，先用待加體積的PBS溶液稀釋后，再加入適當(dāng)?shù)奶J丁儲備液溶液(下同)，制備含1.5×10-5M蘆丁、5.0×10-7M HSA的蘆丁HSA樣品溶液。以待測蘆丁待測樣品空白溶液為對照，測定蘆丁HAS樣品500～250 nm紫外可見吸收光譜。

1.2.2 圓二色光譜(CD)測定

蘆丁UV-Vis CD:吸取適當(dāng)?shù)奶J丁儲備液及HSA儲備溶液，制備合適濃度蘆丁樣品溶液，以其空白溶液為對照，測定蘆丁500～200 nm紫外可見圓二色光譜。

HSA二級結(jié)構(gòu):制備合適濃度HSA溶液，測定其250～190 nm的CD值，楊氏擬合法擬合HSA的二級結(jié)構(gòu)組成。儀器條件:1 mm石英比色池，1 nm狹縫寬度，100 nm/min掃描速度，1 s響應(yīng)值，掃描3次取平均值。

HSA對蘆丁二級結(jié)構(gòu)的影響:固定HSA的含量(5.0×10-8M)，制備蘆丁與HSA不同配比的樣品溶液，測定其250～190 nm的CD值。儀器條件:1 mm石英比色池，1 nm狹縫寬度，100 nm/min掃描速度，1 s響應(yīng)值，掃描3次取平均值。

HSA對蘆丁三級結(jié)構(gòu)的影響:固定HSA的含量(1.0×10-5M)，制備不同蘆丁與HSA配比的樣品溶液，測定其350～250 nm的CD值。儀器條件:10 mm石英比色池，1 nm狹縫寬度，100 nm/min掃描速度，1 s響應(yīng)值，掃描3次取平均值。

1.2.3 熒光光譜測定

HSA熒光激發(fā)光譜:配制系列合適濃度HSA PBS溶液，以320～190 nm波長作為激發(fā)光源，測定345 nm的發(fā)射熒光強(qiáng)度。固定HSA的含量(5.0× 10-8M)，制備蘆丁與HSA不同配比的樣品溶液，測定320～190 nm波長范圍的345 nm的熒光強(qiáng)度。比較以上熒光強(qiáng)度的變化。儀器條件:10 mm石英比色池，狹縫寬度4 nm，100 nm/min掃描速度，1 s響應(yīng)值，掃描3次取平均值。

HSA熒光發(fā)射光譜:固定HSA的含量(1.0× 10-6M)，制備不同蘆丁與HSA不同配比的樣品溶液，測定其300～500 nm的發(fā)射熒光光譜。儀器條件:10 mm石英比色池，激發(fā)波長為283 nm，狹縫寬度4 nm，100 nm/min掃描速度，1s響應(yīng)值，掃描3次取平均值。

蘆丁對HSA熒光發(fā)射光譜的吸收:制備合適濃度HSA溶液，283 nm光源激發(fā)HSA溶液產(chǎn)生發(fā)射熒光光譜，在熒光光路上放置不同濃度的蘆丁溶液，測定300～500 nm的發(fā)射熒光光譜。儀器條件: HSA溶液熒光激發(fā)采用10 mm石英比色池;蘆丁溶液采用1 mm石英比色池。激發(fā)波長為283 nm，狹縫寬度4 nm，100 nm/min掃描速度，1 s響應(yīng)值，掃描3次取平均值;蘆丁溶液采用1 mm石英比色池。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 蘆丁紫外可見吸收光譜及圓二色性分析

蘆丁為黃酮類化合物，具有α-苯基色原酮的基本結(jié)構(gòu)，羰基與二個芳香環(huán)形成兩個較強(qiáng)的共軛系統(tǒng)(圖1)，濃度為1.0，1.5，2.5，5.0×10-5M的蘆丁甲醇溶液，在500～200 nm波長下作光譜掃描，其圖譜見圖2。蘆丁對紫外光譜的兩個區(qū)域有很強(qiáng)的特征吸收。吸收帶I在330～380 nm較長波長范圍最大ε在22000左右，吸收峰歸屬色原酮結(jié)構(gòu)氧原子n→π*的電子躍遷R帶吸收;吸收帶II在240～280 nm波長范圍，最大ε在26000左右，吸收峰歸屬苯環(huán)共軛結(jié)構(gòu)π→π*的電子躍遷B帶吸收。吸收帶III在200～240 nm，最大摩爾吸光系數(shù)ε在48000左右，吸收峰歸屬苯環(huán)雙鍵π→π*的電子躍遷E帶吸收。

當(dāng)平面圓偏振光通過這些光活性的生色基團(tuán)時，光活性中心對平面圓偏振光中的左、右圓偏振光的吸收不相同，產(chǎn)生的吸收差值。由于這種吸收差的存在，造成了偏振光矢量的振幅差，圓偏振光變成了橢圓偏振光，這就是手性化合物的圓二色性。蘆丁的紫外可見圓二色光譜圖見圖3。蕓香糖雖然存在不對稱結(jié)構(gòu)，但在500～200 nm納米范圍內(nèi)沒有光譜吸收，所以在檢測波長范圍內(nèi)不表現(xiàn)CD值。500～330 nm波長范圍內(nèi)蘆丁沒有明顯的CD值，表明原酮結(jié)構(gòu)氧原子處于對稱微環(huán)境中，沒有手性。330～300 nm、300～230 nm波長范圍分別有正的科頓效應(yīng)，這可能與苯環(huán)B對色原酮(C+A環(huán))平面不對稱性有關(guān)。

1.5 ×10-5M的蘆丁溶液吸光度在0.2～0.8范圍，試驗誤差小，因此采用此濃度測定HSA對蘆丁紫外吸收光譜的影響。含5.0×10-7M HSA的1.5 ×10-5M蘆丁溶液500～250 nm波長紫外吸收光譜見圖4。由圖4可見，蘆丁溶液中加入HSA后，其最大紫外吸收峰發(fā)生了紅移;264.0 nm的波峰紅移至267.5 nm，最大ε稍有增加，285.5 nm的波谷紅移至291.5 nm，354.50 nm的波峰紅移至363.0 nm，最大ε明顯降低，并且R吸收帶明顯向長波方向擴(kuò)展(紅移)。紫外吸收波長的紅移表明蘆丁與HSA發(fā)生了相互作用。

圖4 HSA對Rutin紫外吸收光譜的影響Fig.4 The effection of HSAon the rutin’s UV-Vis absorption spectrum

由于蘆丁在500～330 nm波長范圍內(nèi)沒有明顯的CD值，而330～190 nm以下HSA的CD值很明顯，會給蘆丁CD值分析帶來很大干擾，因此很難測定及分析HSA作用對蘆丁手性的影響。

2.2 蘆丁對HSA結(jié)構(gòu)的影響

圓二色光譜能夠靈敏地反映蛋白質(zhì)溶液構(gòu)象的改變［12］。在蛋白質(zhì)或多肽中，主要的光活性基團(tuán)是肽鏈骨架中的肽鍵、芳香氨基酸殘基及二硫橋鍵。蛋白質(zhì)的CD光譜一般分為兩個波長范圍，即190～250 nm為遠(yuǎn)紫外區(qū)CD光譜，250～320 nm為近紫外區(qū)CD光譜。遠(yuǎn)紫外區(qū)CD光譜由肽鍵產(chǎn)生，反映蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的圓二色性。在蛋白質(zhì)或多肽的二級結(jié)構(gòu)中，肽鍵是高度有規(guī)律排列的。排列的方向性決定了肽鍵能級躍遷的分裂情況。因此，具有不同二級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)或多肽所產(chǎn)生CD譜帶的位置、吸收的強(qiáng)弱都不相同。近紫外CD主要由側(cè)鏈芳香基團(tuán)、二硫鍵等生色基團(tuán)產(chǎn)生，近紫外CD與蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。

2.2.1 HSA二級結(jié)構(gòu)的影響

HSA和蘆丁的190～250 nm的圓二色光譜圖見圖5?？梢娤嗤瑵舛鹊腍SA溶液中，HSA與蘆丁比例從2∶1～1∶20，HSA的208及222 nm處的α-螺旋特征光譜變化沒有濃度依賴關(guān)系;造成其光譜微細(xì)差異主要由實驗樣品間濃度差異造成。蘆丁對HSA在190～250 nm的圓二色光譜并沒有明顯影響，表明蘆丁與HSA發(fā)生作用后并沒有引起HSA二級結(jié)構(gòu)的變化。本實驗結(jié)果與吳錦繡等［13］認(rèn)為蘆丁引起HSA二級結(jié)構(gòu)的改變有矛盾。其可能的原由:(1)供試品與對照品HSA的濃度差異造成。HSA的圓二色性很強(qiáng)，濃度稍有差異，對HSA在200～230 nm的CD值影響明顯;(2)蘆丁甲醇儲備液加入高濃度HSA儲備液后，再加入PBS溶液稀釋成所需濃度的供試樣品。甲醇對HSA的二級結(jié)構(gòu)組成有一定的影響(圖6)，在低含量下(小于10%)，甲醇對HSA二級結(jié)構(gòu)影響不明顯;但甲醇含量較高時，HSA二級結(jié)構(gòu)改變明顯，208及222 nm處的α-螺旋特征光譜明顯減弱。

圖7 蘆丁對HAS三級結(jié)構(gòu)的影響Fig.7 The effection of rutin on the tertiary structure of HSA

2.2.2 HSA三級結(jié)構(gòu)的影響

HSA和蘆丁的250～350 nm的圓二色光譜圖見圖7?？梢?，蘆丁對HSA 250～350 nm的CD光譜有輕微的影響。HSA在250～270 nm有精細(xì)的CD光譜值，其CD值主要來自芳香氨基酸殘基中測量色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)的貢獻(xiàn)。HSA在262及268 nm處有兩個精細(xì)的最大CD值;在蘆丁存在條件下，明顯的加強(qiáng)這兩個CD波峰值。表明蘆丁與HSA發(fā)生作用后引起HSA三級結(jié)構(gòu)的變化。

2.3 蘆丁對HSA熒光光譜的影響

HSA中含有芳香氨基酸，使其具有很強(qiáng)的內(nèi)源熒光性，當(dāng)某些小分子如藥物與蛋白質(zhì)結(jié)合后，會導(dǎo)致HSA激發(fā)及發(fā)射光譜特性的改變。藥物與蛋白質(zhì)結(jié)合后，導(dǎo)致蛋白質(zhì)熒光強(qiáng)度下降現(xiàn)象，這種現(xiàn)象稱為藥物對蛋白質(zhì)的熒光猝滅作用。但當(dāng)藥物在HSA的發(fā)射熒光光譜范圍內(nèi)有強(qiáng)烈的吸收時，在同一溶液中即使藥物與HSA沒有發(fā)生直接的結(jié)合作用，也能導(dǎo)致檢測器中HSA熒光強(qiáng)度下降，造成藥物對熒光猝滅作用的假象。我們曾經(jīng)報道隨著蘆丁濃度的增加HSA內(nèi)源熒光強(qiáng)度逐漸降低現(xiàn)象［14］，但我們沒有考慮到蘆丁自身對HSA發(fā)射熒光的吸收因素。HSA內(nèi)源熒光強(qiáng)度的降低究竟是由蘆丁的電子吸收作用引起的，還是由蘆丁與HSA發(fā)生分子相互作用后引起的，還有待進(jìn)一步的研究。本部分重新考查了蘆丁與HSA的相互作用及對HSA熒光光譜的影響。

2.3.1 HSA熒光激發(fā)光譜

圖8 HSA激發(fā)熒光光譜Fig.8 The excitation fluorescence spectra of HSA

配制1.0×10-7～1.0×10-6M HSA的PBS溶液，以190～320 nm波長光源作為激發(fā)光源，記錄345 nm處HSA的熒光發(fā)射光強(qiáng)，考察HSA濃度對其熒光激發(fā)光譜的影響。HSA熒光激發(fā)光譜見圖8，PBS在190～320 nm波長光源激發(fā)下不產(chǎn)生熒光，對HSA熒光強(qiáng)度測定無干擾。HSA的最大激發(fā)波長在280 nm附近，隨HSA的濃度稍有變化，當(dāng)HSA濃度當(dāng)1.0×10-7M升高到1.0×10-6M時，最大激發(fā)波長從280 nm變化到283 nm。280 nm附近激發(fā)光源下，HSA的熒光發(fā)射光強(qiáng)與其濃度呈依賴關(guān)系，隨HSA濃度的升高而增大。在250～300 nm范圍內(nèi)芳香氨基酸的側(cè)鏈生色基團(tuán)有較強(qiáng)的紫外吸收，HSA中含有酪氨酸及色氨酸殘基，280 nm附近激發(fā)光源的HSA熒光發(fā)射光譜主要為酪氨酸及色氨酸殘基激發(fā)的內(nèi)源性熒光。

值得注意的是，230左右nm的激發(fā)光源下，HSA的熒光發(fā)射光強(qiáng)與濃度沒有依賴關(guān)系。

2.3.2 蘆丁對HSA熒光激發(fā)光譜影響

芳香氨基酸殘基的激發(fā)波普與其所處的微環(huán)境，特別是疏水性有關(guān)，蛋白質(zhì)與藥物結(jié)合后可能會對芳香氨基酸殘基的微環(huán)境產(chǎn)生影響，其最大激發(fā)波長可能會產(chǎn)生變化。

配制1.0×10-6M HSA的PBS溶液及其不同蘆丁含量的PBS溶液，以190～320 nm波長光源作為激發(fā)光源，記錄345 nm處HSA的熒光發(fā)射光強(qiáng)，考察蘆丁對HSA熒光激發(fā)光譜的影響。蘆丁對HSA熒光激發(fā)的影響光譜見圖9。蘆丁在190～320 nm波長光源激發(fā)下不產(chǎn)生熒光，對HSA熒光強(qiáng)度測定無干擾。蘆丁對HSA的最大激發(fā)波長產(chǎn)生明顯的影響，在相同HSA濃度下，當(dāng)蘆丁濃度從1.0×10-8M升高到5.0×10-6M時(HSA與蘆丁的摩爾比100∶1～1∶5)，最大激發(fā)波長從283 nm變化到286 nm。表明蘆丁對HSA中酪氨酸及色氨酸殘基側(cè)鏈生色基團(tuán)的微環(huán)境產(chǎn)生了影響，而這種影響與HSA蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象變化密切相關(guān)。

圖9 蘆丁對HSA激發(fā)熒光光譜的影響Fig.9 The effection of rutin on excitation fluorescence spectra of HSA

2.3.3 蘆丁對HSA熒光發(fā)射光譜影響

配制1.0×10-6M HSA的PBS溶液及其不同蘆丁含量的PBS溶液，以283 nm波長光源作為激發(fā)光源，記錄300～450 nm波長范圍的HSA熒光發(fā)射光譜，考察蘆丁對HSA熒光發(fā)射光譜的影響，結(jié)果見圖10。蘆丁溶液本身不產(chǎn)生熒光，因此，研究中不用考慮“內(nèi)濾光效應(yīng)”的干擾。固定HSA的量，改變蘆丁與HSA的含量比例，隨著蘆丁濃度的增加，HSA的內(nèi)源熒光強(qiáng)度有規(guī)律地降低，當(dāng)HSA與蘆丁濃度比達(dá)到1∶12時，基本檢測不到HSA的發(fā)生熒光光強(qiáng)。這種熒光發(fā)生強(qiáng)度的降低來源于:(1)蘆丁本身對300～450 nm光譜的吸收;(2)蘆丁對HSA酪氨酸及色氨酸殘基側(cè)鏈生色基團(tuán)的微環(huán)境產(chǎn)生影響，部分抑制了其產(chǎn)生熒光的能力。

HSA在345 nm附近的發(fā)射峰可歸屬于其酪氨酸及色氨酸殘基的發(fā)生熒光，而酪氨酸、色氨酸殘基的最大發(fā)射波長與其所處的微環(huán)境相關(guān)［8］。蘆丁-HSA溶液體系中，HSA熒光最大發(fā)射峰位及峰形隨蘆丁濃度的增加發(fā)生藍(lán)移，相同1.0×10-6M HSA濃度條件下，當(dāng)蘆丁濃度由1.0×10-7M升高到8.0 ×10-6M時，HSA最大發(fā)射熒光峰位從345 nm藍(lán)移到338 nm(最大熒光強(qiáng)度由5.0下降到0.15左右)。

為了探討蘆丁對HSA發(fā)射熒光光譜直接吸收的影響，設(shè)計以下實驗:在HSA溶液發(fā)生熒光光路上，放置蘆丁溶液，記錄經(jīng)蘆丁溶液吸收后的HSA熒光發(fā)射光譜。實驗結(jié)果見圖11。蘆丁對HSA發(fā)射熒光有較強(qiáng)的吸收作用，相同1.0×10-6M HSA濃度條件下，HSA發(fā)射熒光強(qiáng)度隨蘆丁濃度的增加而降低，但是與蘆丁-HSA溶液體系不同的是:(1)即使HSA與蘆丁濃度比達(dá)到1∶50時，仍能檢測到一定的HSA熒光光強(qiáng);并且蘆丁對360 nm附近的熒光有較強(qiáng)的吸收作用，這與蘆丁的360附近有最大吸收的紫外吸收光譜相吻合。(2)在相近發(fā)射熒光強(qiáng)度條件下，最大發(fā)射熒光峰位發(fā)生更大的藍(lán)移，HSA最大發(fā)射熒光峰位從345 nm藍(lán)移到326 nm (最大熒光強(qiáng)度由0.45下降到0.22左右)。

以上實驗結(jié)果表明，蘆丁-HSA溶液體系中，蘆丁除了本身對300～450 nm光譜的有吸收外，蘆丁與HSA分子之間確實發(fā)生了相互作用，蘆丁對HSA酪氨酸及色氨酸殘基側(cè)鏈生色基團(tuán)的微環(huán)境產(chǎn)生影響，部分抑制了其產(chǎn)生熒光的能力。HSA發(fā)射的熒光能量向蘆丁發(fā)生了轉(zhuǎn)移，蘆丁對HSA的熒光有猝滅作用。

3 結(jié)論

蘆丁是重要的黃酮類生物活性物質(zhì)，其經(jīng)常作為黃酮類化合物的模型化合物，研究黃酮類物質(zhì)的理化性質(zhì)及生理活性。HSA是血漿中含量最豐富的載體蛋白，是生物活性物質(zhì)發(fā)揮生物效應(yīng)的重要載體和靶向分子。HSA影響蘆丁的紫外吸收光譜;蘆丁與HSA相互作用，其不引起HSA二級結(jié)構(gòu)的改變，但對HSA三級結(jié)構(gòu)分子構(gòu)象有一定的影響。以蘆丁為黃酮類物質(zhì)的分子模型，開展黃酮類物質(zhì)與HSA分子相互作用的研究，探討黃酮類物質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用機(jī)制，對揭示黃酮類藥物藥效具有重要意義。

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The UV-Vis Spectrum Analysis on the Interaction between Rutin and Human Serum Albumin

HUANG Han-chang1*，JIANG Zhao-feng21College of Arts and Science of Beijing Union University;2Beijing Key Laboratory of Bioactive Substances and Functional Foods of Beijing Union University，Beijing 100191，China

In order to inveatigate the interaction between rutin and human serum albumin(HSA)，this article determined the ultraviolt-visible(UV-Vis)absorption spectrum，circular diachroism and HSA fluorescence spectrum，and further to analyse the difference between the spectra before and after rutin and HSA mixed.The results indicated that rutin shows three particular UV absorption-peak at the wavelength 264.0，285.5 and 354.5 nm and circular diachroism at the wavelength ranges 330～300 nm and 300～230 nm.When rutin interacted with HSA，the UV absorption peak of Rutin will be shifted to long wavelength.However，for the structure of HSA，rutin will change the HSA tertiary structure rather than secondary strcture.The fluoresence of HSA is also influenced by rutin.The excitation wavelength will be shift towards long wavelength，while emission wavelength will be shift towards short wavelength when HSA interacted with rutin.

rutin;Human Serum Albumin(HSA);UV-Vis absorption;Circular Diachroism;fluorescence

1001-6880(2011)03-0476-06

2009-09-09 接受日期:2010-01-21

北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院科學(xué)研究發(fā)展基金，北京市教育委員會科技計劃項目資助(KM201011417002)。

*通訊作者 Tel:86-10-62004534;E-mail:hanchang@ygi.edu.cn

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