趙燕英，汪俊漢，陳正望

1西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都610041;2華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院; 3華中科技大學(xué)校醫(yī)院，武漢430074

巨噬細(xì)胞因子daintain激活血液炎癥反應(yīng)

趙燕英1，2*，汪俊漢3，陳正望2

1西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都610041;2華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院;3華中科技大學(xué)校醫(yī)院，武漢430074

Daintain是我們鑒定并命名的巨噬細(xì)胞炎癥因子。多個(gè)小組的研究表明daintain與炎癥密切相關(guān)，但截至目前尚缺乏兩者關(guān)聯(lián)的直接證據(jù)。本實(shí)驗(yàn)研究了daintain對(duì)昆明鼠血液C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)和纖維蛋白原的影響，結(jié)果表明daintain促進(jìn)血液CRP的增高，激活纖維蛋白原，此外還觀察到daintain增加了血液粘度并加速血液凝固。這些結(jié)果提示daintain可直接激發(fā)血管炎癥反應(yīng)，可能促進(jìn)心血管疾病的發(fā)生。

daintain;C反應(yīng)蛋白;纖維蛋白原;炎癥

炎癥是具有血管系統(tǒng)的活體組織對(duì)損傷因子所發(fā)生的防御反應(yīng)。通常情況下，炎癥是有益的，是人體的自動(dòng)應(yīng)激反應(yīng)，但是有的時(shí)候，炎癥也是有害的，例如對(duì)人體自身組織的攻擊、發(fā)生在透明組織的炎癥等［1，2］。血管反應(yīng)是炎癥過程的中心環(huán)節(jié)。

二十世紀(jì)90年代中期，我們?cè)谘芯课改c多肽激素對(duì)胰腺β細(xì)胞分泌影響的時(shí)候，從豬小腸中分離鑒定出了一個(gè)蛋白，命名為daintain(Da，大big;in，炎癥 inflammatory;tai，肽 peptide;in，因子 factor)［3，4］，不同小組研究表明細(xì)胞因子干擾素γ可上調(diào)其轉(zhuǎn)錄水平，daintain是巨噬細(xì)胞激活過程中的一個(gè)免疫調(diào)節(jié)器［5］;daintain對(duì)于巨噬細(xì)胞的存活和前炎癥(pro-inflammatory)活力至關(guān)重要［6］;而抑制daintain的表達(dá)減弱了動(dòng)脈粥樣硬化刺激的巨噬細(xì)胞的遷移、增生和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［7］。這些研究都顯示了daintain與炎癥的密切關(guān)系。但尚缺乏daintain促進(jìn)炎癥反應(yīng)的直接證據(jù)。本文擬探討daintain在血管中對(duì)炎癥反應(yīng)的影響。

1 材料和方法

1.1 主要材料

10周齡昆明鼠購自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，丙烯酰胺、N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺、SDS、過硫酸胺、TEMED、溴酚蘭、考馬斯亮藍(lán)R-250、β-2-巰基乙醇均購自Bio-Rad公司，NC膜購自Millipore公司，化學(xué)發(fā)光劑購自Pierce，辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG二抗購自Santa Cruz公司，蛋白電泳儀轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)購自Bio-Rad公司。

臨床化學(xué)分析儀CL-8000S購自日本HIMADZU公司，纖維蛋白原由Sysmex株式會(huì)社CA系列全自動(dòng)凝血分析儀檢測，纖維蛋白原檢測試劑盒購自德國Dade Behirng公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 daintain純化和鑒定

按照先前報(bào)道的方法［2］純化daintain。主要過程包括組織切碎、高溫滅活蛋白酶、稀醋酸浸提、海藻酸吸附、NaCl鹽析、異丙醇分級(jí)提取、Sephadex G25凝膠過濾、DEAE纖維素離子交換層析和多次高效液相色譜法純化。將純化組分經(jīng)12%SDSPAGE分離，考馬斯亮藍(lán)染色;另外電泳樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)膜和封閉后，依次經(jīng)過 daintain單克隆抗體［8］(1∶1000)、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG二抗(1∶5000)孵育以及化學(xué)發(fā)光劑顯影和定影，鑒定純化組分。

1.2.2 C反應(yīng)蛋白和纖維蛋白原檢測

將18只昆明鼠隨機(jī)分為兩組，每組9只，其中一組靜脈注射溶于生理鹽水的daintain，劑量為5 μg/g體重，對(duì)照組注射相同體積生理鹽水。30 h后對(duì)昆明鼠心臟取血，枸櫞酸鈉抗凝，生化分析儀檢測血液中C反應(yīng)蛋白水平，全自動(dòng)凝血分析儀檢測纖維蛋白原。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)分析

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論

2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 Daintain純化鑒定

高效液相色譜分離后的蛋白組分經(jīng)過 SDSPAGE后，其分子量介于14.4～18.4 kDa之間初步符合daintain(17 kD)的分子量大小(如圖1所示，其中1為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，2為純化樣品)。

圖1 純化組分的SDS-PAGE圖譜Fig.1 SDS-PAGE of purified aliquot

將純化的蛋白組分與daintain單克隆抗體孵育后，其可與daintain抗體發(fā)生特異性結(jié)合，說明純化組分為daintain蛋白(如圖2，圖中斑點(diǎn)為純化組分與daintain抗體特異性結(jié)合斑點(diǎn))。

圖2 純化組分的western blot圖譜Fig.2 Western blot of purified aliquot

2.1.2 C反應(yīng)蛋白和纖維蛋白原檢測

昆明鼠靜脈注射daintain后，其血液中C反應(yīng)蛋白平均值為2.32±0.47 mg/L，濃度高于對(duì)照組C反應(yīng)蛋白平均值(0.90±0.46 mg/L)，差異顯著(P＜0.05)結(jié)果見圖3。

圖3 daintain對(duì)血液C反應(yīng)蛋白水平的影響Fig.3 Assays of C-reactive protein in the blood

而注射daintain后的昆明鼠血漿纖維蛋白原的平均值為1.36±0.15 g/L，顯著高于對(duì)照組纖維蛋白原平均水平(0.89±0.16 g/L)(P＜0.05)，結(jié)果見圖4。

圖4 daintain對(duì)血液纖維蛋白原濃度的影響Fig.4 Assays of fibrinogen in the blood

在檢測注射daintain鼠血漿C反應(yīng)蛋白和纖維蛋白原升高的同時(shí)，取血時(shí)，在沒有抗凝劑存在的情況下，注射daintain組昆明鼠血液粘度增加且血凝時(shí)間縮短。

2.2 討論

C反應(yīng)蛋白是炎癥標(biāo)志物，具有激活補(bǔ)體和加強(qiáng)吞噬細(xì)胞吞噬的作用。在發(fā)熱性疾病、各種炎癥狀態(tài)和創(chuàng)傷時(shí)，血液中C反應(yīng)蛋白水平會(huì)明顯增高，C反應(yīng)蛋白的檢測作為炎癥和組織損傷的非特異性標(biāo)志物大量應(yīng)用于臨床［9］。本實(shí)驗(yàn)中巨噬細(xì)胞因子 daintain促進(jìn) C反應(yīng)蛋白水平升高，說明daintain可直接激起炎癥反應(yīng)的發(fā)生。同時(shí)也部分解釋了其他小組所報(bào)道的daintain激活巨噬細(xì)胞，對(duì)其遷移增生非常必要［6，7］。

纖維蛋白原是除C反應(yīng)蛋白外另一種急性時(shí)相蛋白，是發(fā)生炎癥反應(yīng)的另一指標(biāo)。其主要生理功能是作為凝血因子I直接參與體內(nèi)凝血過程。研究發(fā)現(xiàn)纖維蛋白原含量升高有促進(jìn)心血管病發(fā)生的作用［10］。我們的實(shí)驗(yàn)顯示daintain激活了纖維蛋白原，也確實(shí)觀察到daintain增加了血液粘度，促進(jìn)了血液凝固，暗示了daintain可能會(huì)促進(jìn)心血管疾病的發(fā)生。

心血管疾病的病理基礎(chǔ)是動(dòng)脈粥樣硬化。由于炎癥在動(dòng)脈粥樣硬化病理過程的各個(gè)階段中均發(fā)揮著主導(dǎo)作用［11］，因此，包括C反應(yīng)蛋白和纖維蛋白原在內(nèi)的重要炎癥因子在動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測及致病機(jī)理中作用的研究，獲得了廣泛關(guān)注［12］。本實(shí)驗(yàn)中daintain激活了C反應(yīng)蛋白和纖維蛋白原。因此，daintain可能在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中扮演一定的角色。圍繞這一主題，后續(xù)研究可從daintain對(duì)免疫細(xì)胞的激活和泡沫細(xì)胞的形成等方面開展。

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Macrophage Cytokine Daintain Stimulates Inflammatory Reaction in the Blood

ZHAO Yan-ying1，2*，WANG Jun-han3，CHEN Zheng-wang21College of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，China;2School of Life Science and Technology，Huazhong University of Science and Technology;3Huazhong University of Science and Technology Hospital，Wuhan 430074，China

Daintain is a macrophage inflammatory factor characterized by us.There is an intimate relationship between daintain and inflammation without direct evidence by now.In the present study，we demonstrated that daintain increases the level of C-reactive protein(CRP)and actives fibrinogen in the blood with higher blood viscosity and faster blood coagulation.The results indicated that daintain invokes inflammatory reactions in the blood directly，suggesting that daintain may be involved in cardiovascular disease.

daintain;CRP;fibrinogen;inflammation

1001-6880(2011)03-0425-03

2011-04-07 接受日期:2011-05-11

國家“863”高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(2002AA214061)，國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30370647、30470823)

*通訊作者 E-mail:biozyy@163.com

R284.2

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