吳 迪，吳桂榮，阿布力孜·阿布杜拉，盛 磊，巴哈爾古麗·卡哈爾*

1新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥化有機(jī)教研室; 2新疆醫(yī)科大學(xué)新疆地方病分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊830011

不同ω-3/ω-6構(gòu)成比的配伍紅花籽油對SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷的預(yù)防效應(yīng)

吳 迪1，吳桂榮1，阿布力孜·阿布杜拉2，盛 磊2，巴哈爾古麗·卡哈爾1*

1新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥化有機(jī)教研室;2新疆醫(yī)科大學(xué)新疆地方病分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊830011

探討不同ω-3/ω-6構(gòu)成比的配伍紅花籽油(Compatibility Safflower Seed Oil，CSSO)預(yù)防神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷的作用。通過過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)氧自由基供體誘導(dǎo)，建立人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷模型;以不同濃度和ω-3/ω-6構(gòu)成比的CSSO進(jìn)行細(xì)胞藥物干預(yù)，利用四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)和流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞活力變化和細(xì)胞凋亡率。我們建立了H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷模型，其IC50值為1089.54 μmol/L H2O2;隨著ω-3相對含量遞減，CSSO預(yù)防細(xì)胞氧化損傷的效應(yīng)增加，且當(dāng)ω-3/ω-6比例為1∶6.68和有效濃度范圍為375～750 μg CSSO/mL時(shí)，其藥物干預(yù)組細(xì)胞活力(84.1%)顯著高于模型組(61.1%)，而藥物干預(yù)組細(xì)胞凋亡率(12.6%)明顯低于模型組(25.9%)。從以上結(jié)果可以推測，CSSO能夠保護(hù)細(xì)胞并預(yù)防氧自由基誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，其效果可能與CSSO中ω-3/ω-6構(gòu)成比密切相關(guān)。

配伍紅花籽油;氧化損傷;SH-SY5Y;MTT

配伍紅花籽油(Compatibility Safflower Seed Oil， CSSO)是由新疆地產(chǎn)紅花籽油與胡麻油皂化產(chǎn)物混酸以一定的比例配伍而成的創(chuàng)新配伍使用油，主要有效成分為ω-3、ω-6多不飽和脂肪酸。以往的研究證實(shí)，CSSO具有降血脂［1］、防止動脈粥樣硬化、抗凝血、防止血栓形成等藥理作用［2］。此外，CSSO對于腦、視網(wǎng)膜、神經(jīng)組織發(fā)育具有一定的調(diào)節(jié)作用［3］。本研究擬建立H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株(SH-SY5Y)氧化損傷模型，以原料紅花籽油(Safflower Seed Oil，SSO)，混酸(Mix-Polyunsaturated fatty acid，Mix-PUFA)及不同ω-3/ω-6構(gòu)成比的CSSO干預(yù)細(xì)胞，研究CSSO保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞并預(yù)防自由氧基引起的細(xì)胞氧化損傷的效應(yīng)，為更好的利用新疆紅花資源和新藥研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

SH-SY5Y細(xì)胞由中國科學(xué)院上海分院細(xì)胞庫提供。D-MEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(GIBCO公司);四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、抗菌素、胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMSO)、磷酸平衡鹽(PBS)(Sigma和Invitrogen公司);Annexin V-FITC試劑盒(Calbiochem公司);細(xì)胞培養(yǎng)所需的低值易耗品來自Corning或Exogen公司。不同比例配伍紅花籽油由新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥化有機(jī)教研室紅花課題組提供。CO2孵育箱(HERA cell 150，Thermo公司);生物安全柜(KS18，Thermo公司);倒置顯微鏡(BH-2，Olympus公司);臺式離心機(jī)(3-18K，Sigma公司);酶標(biāo)儀(AD 340，Beckmann Coulter);流式細(xì)胞儀(LSRⅡ，BD公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

配制含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的D-MEM/F12養(yǎng)基，在5%CO2和37℃條件下培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞，每隔1 d更換一次培養(yǎng)基，待細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時(shí)，用胰蛋白酶(0.25%)消化法以1∶2的比例傳代。

1.3 不同ω-3/ω-6構(gòu)成比的CSSO母液制備

以1∶4比例(v/v)將CSSO溶于DMSO，配制0.25 g/mL的CSSO母液，并在使用時(shí)，用D-MEM/ F12完全培養(yǎng)基稀釋藥物至所需濃度(培養(yǎng)基中DMSO終濃度約為0.7%)。

1.4 MTT法檢測細(xì)胞活力

取對數(shù)生長期的SH-SY5Y細(xì)胞，接種于96孔板(密度為3×105個/mL)，每孔200 μL，按預(yù)定濃度進(jìn)行各種藥物或試劑(CSSO、H2O2)干預(yù)后，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)，并換成等體積的無血清培養(yǎng)基。在37℃和5%CO2細(xì)胞孵育箱培養(yǎng)4 h后，棄去培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO，待細(xì)胞內(nèi)紫色結(jié)晶溶解后，利用酶標(biāo)儀測定其570 nm處吸光度值(OD值)，并判斷細(xì)胞活力。細(xì)胞活力及抑制率分別按以下公式計(jì)算:

1.5 細(xì)胞凋亡率的流式細(xì)胞儀檢測

選擇對數(shù)生長期的SH-SY5Y細(xì)胞，以4×106個/mL的密度種植于25 cm2培養(yǎng)瓶，每瓶1 mL，培養(yǎng)20～24 h后進(jìn)行藥物干預(yù)。待所有藥物干預(yù)過程完成后，收集細(xì)胞，參照Annexin V-FITC試劑盒說明書處理細(xì)胞，并于流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率，主要步驟包括:細(xì)胞懸浮、結(jié)合Annexin V-FITC(1.25 μL)和碘化丙啶(PI，10 μL)，以及流式細(xì)胞儀檢測。流式細(xì)胞儀分析條件:激發(fā)波長Ex=488 nm;發(fā)射波長Em=530 nm。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性、方差齊性檢驗(yàn)，若同時(shí)滿足正態(tài)性、方差齊用單因素方差LSD進(jìn)行組間比較，若方差不齊則用Dunnett T3檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，P≤0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H2O2誘導(dǎo)及SH-SY5Y細(xì)胞活力的變化

表1 濃度梯度H2O2對細(xì)胞活力的影響Table 1 Influence of H2O2on growth and viability of SH-SY5Y cells in different concentration

2.2 CSSO對H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷的影響

由于CSSO是脂溶性化合物，進(jìn)行細(xì)胞藥物干預(yù)需要適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑。我們選擇DMSO為溶劑，經(jīng)細(xì)胞毒性試驗(yàn)，確定其安全濃度范圍為0～2%。通過細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，設(shè)定各配伍比例的用藥濃度范圍。

分別設(shè)置濃度梯度的Mix-PUFA(ω-3/ω-6 1∶0.25)、SSO(ω-3/ω-6 0∶1)、CSSO 1(ω-3/ω-6 1∶1.18)、CSSO 2(ω-3/ω-6 1∶6.68)、CSSO 3(ω-3/ω-6 1∶16.1)，預(yù)干預(yù)細(xì)胞24 h，1000 μmol/L H2O2誘導(dǎo)3 h后，MTT結(jié)果顯示(表2)，Mix-PUFA在25～100 μg/mL濃度范圍內(nèi)，與模型組相比細(xì)胞活力基本無變化(P＞0.05)，提示其對SH-SY5Y細(xì)胞的氧化損傷基本無預(yù)防作用;SSO在187.5～375 μg/mL濃度范圍內(nèi)時(shí)，可維持SH-SY5Y細(xì)胞活力在79.04～80.27%之間，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。濃度高于375 μg/ mL時(shí)細(xì)胞活力開始下降，可能因其對細(xì)胞產(chǎn)生一定的毒性所致。

CSSO 1濃度增加保護(hù)作用增強(qiáng)，在60～240 μg/mL濃度范圍內(nèi)與模型組(68.67%)相比，細(xì)胞活力先升高后降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，120 μg/mL時(shí)細(xì)胞活力最大(84.62%)。濃度高于120 μg/mL時(shí)，細(xì)胞活力開始下降，提示可能出現(xiàn)細(xì)胞毒性，預(yù)防程度與SSO相比稍有增強(qiáng)，但有效濃度范圍與SSO相比減小。CSSO 2在187.5～1125 μg/mL濃度范圍內(nèi)可有效保護(hù)細(xì)胞，與模型組相比(61.17%)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。在187.5～750 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，濃度增加預(yù)防作用增強(qiáng)，750 μg/mL時(shí)，細(xì)胞活力最大(84.14%)，高于750 μg/mL時(shí)細(xì)胞活力開始下降，但程度不明顯，提示可能因細(xì)胞毒性或?qū)嶒?yàn)誤差所致。CSSO 2預(yù)防細(xì)胞氧化損傷的作用與SSO及CSSO 1相比增強(qiáng)，與CSSO1相比有效濃度范圍增加，與SSO相比縮小，對細(xì)胞的保護(hù)程度相對最佳。

CSSO 3在175～2000 μg/mL濃度范圍內(nèi)隨著濃度增加，預(yù)防細(xì)胞氧化損傷的作用增強(qiáng)，與模型組(68.16%)相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)，2000 μg/mL時(shí)，細(xì)胞活力最大(85.83%)其有效范圍與SSO相近，但程度有所增強(qiáng)。與SSO、Mix-PUFA及其它CSSO相比預(yù)防細(xì)胞氧化損傷的有效濃度范圍最寬，但保護(hù)的程度與CSSO 2相比較弱。綜合評價(jià)CSSO 3預(yù)防細(xì)胞損傷的效果優(yōu)于CSSO 1、Mix-PUFA、SSO，但低于CSSO 2。相關(guān)性分析結(jié)果表明，SSO、Mix-PUFA及CSSO對SH-SY5Y細(xì)胞的預(yù)防作用均不存在劑量-效應(yīng)線性相關(guān)性。

表3 CSSO預(yù)干預(yù)后，氧自由基引起的SH-SY5Y細(xì)胞活力變化Table 3 The cell viability change of SH-SY5Y after the treatment of CSSO

2.3 流式細(xì)胞技術(shù)檢測CSSO 2預(yù)干預(yù)后，對SHSY5Y細(xì)胞凋亡率的影響

根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇預(yù)防氧化損傷綜合效果較好的ω-3/ω-6構(gòu)成比，即CSSO 2(ω-3/ω-6，1∶6.68)，進(jìn)一步研究揭示CSSO 2預(yù)防氧自由基誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的作用。CSSO 2預(yù)干預(yù)24 h，H2O2誘導(dǎo)3 h后，用Annexin V-FITC/PI熒光染色劑染色后，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率(圖1)。正常生長的細(xì)胞幾乎沒有發(fā)生細(xì)胞凋亡(0.8%)，而模型組細(xì)胞凋亡率達(dá)25.9%(圖1，B)。經(jīng)CSSO 2(375和750 μg/mL)預(yù)干預(yù)后，細(xì)胞凋亡率分別下降至12.6%和13.6%，(圖1中C和D)。與MTT實(shí)驗(yàn)所得結(jié)論基本吻合，說明CSSO 2在此濃度時(shí)，可有效預(yù)防氧自由基誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。濃度為1125 μg/mL時(shí)細(xì)胞凋亡率與模型組相比有所增加，與MTT結(jié)果不完全吻合，可能大劑量使用時(shí)該濃度體現(xiàn)出細(xì)胞毒性。

圖1 CSSO 2干預(yù)后，對氧自由基引起SH-SY5Y細(xì)胞凋亡率的影響Fig.1 The effects of apoptosis rates cause by oxygen free radical after the treatment of CSSO 2

3 討論

近年來，研究發(fā)現(xiàn)阿爾茨海默氏癥、老年癡呆等多種神經(jīng)退行性疾病(Neurodegenerative Diseases，ND)的發(fā)生與活性氧的介入密切相關(guān)，活性氧的產(chǎn)生及其對生物大分子的損傷機(jī)理研究受到各領(lǐng)域的普遍重視［4］。

CSSO主要生理活性成分為ω-3、ω-6系列多不飽和脂肪酸α-亞麻酸和亞油酸。據(jù)已有研究報(bào)道，α-亞麻酸和亞油酸在細(xì)胞內(nèi)代謝轉(zhuǎn)變成DHA、EPA、ARA等二十烷類衍生物，在體內(nèi)發(fā)揮重要的生理作用。α-亞麻酸的代謝產(chǎn)物DHA是視網(wǎng)膜及神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞膜的主要組成成分，可提高神經(jīng)細(xì)胞的生存能力及傳導(dǎo)能力［5］，增加細(xì)胞膜的流動性，作用機(jī)理尚未查證。

本研究選擇SH-SY5Y細(xì)胞作為神經(jīng)細(xì)胞的模型，以H2O2為刺激源，建立了SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷模型，并以二甲基亞砜(DMSO)為脂溶性CSSO的溶劑，對細(xì)胞進(jìn)行預(yù)干預(yù)。MTT結(jié)果顯示，配伍紅花籽油2(CSSO 2)預(yù)防細(xì)胞氧化損傷作用相對最好，在187.5～1125 μg/mL濃度范圍內(nèi)有效。流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率提供了更客觀的依據(jù)，進(jìn)一步確定最佳有效預(yù)防細(xì)胞氧化損傷的濃度范圍為375～750 μg/mL。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，混酸(Mix-PUFA)細(xì)胞毒性較大，配伍紅花籽油3(CSSO 3)在保證一定的細(xì)胞存活率的前提下，有效濃度范圍相對較寬(175～2000 μg/mL)。提示，配伍紅花籽油(CSSO)中ω-3的相對量，對預(yù)防細(xì)胞氧化損傷起決定性作用，其濃度相對較低時(shí)，可提高CSSO的有效濃度范圍，但保護(hù)程度降低，當(dāng)其含量達(dá)到某一值時(shí)(ω-3/ω-6 1∶6.68)雖然有效濃度范圍縮小，但對細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)效果提高約10%，由此推測CSSO對氧化損傷引起的ND可能有潛在的預(yù)防作用，且這種作用可能與ω-3和ω-6的比例直接相關(guān)。由MTT實(shí)驗(yàn)可知，CSSO對細(xì)胞氧化損傷的預(yù)防效果明顯優(yōu)于配伍原料SSO和Mix-PUFA，充分體現(xiàn)了配伍使用的優(yōu)越性。

目前，治療ND的藥物以膽堿酯酶抑制為主，該類型的藥物存在半衰期短、較嚴(yán)重的外周膽堿能系統(tǒng)副作用、肝毒性等缺點(diǎn)，臨床應(yīng)用前景受到限制［6，7］。因此，對ND治療藥物的研究，逐漸轉(zhuǎn)向天然抗氧化活性物質(zhì)的開發(fā)。通過本研究，我們可認(rèn)為一定ω-3、ω-6構(gòu)成比的配伍紅花籽油具有預(yù)防氧自由基誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷(凋亡)的效應(yīng)，有作為天然預(yù)防ND的抗氧化活性物質(zhì)開發(fā)的潛力，為新疆紅花藥用資源的開發(fā)與利用提供理論依據(jù)。

1Wu GR(吳桂榮)，Mao XM(毛新民)，Wang Y(王巖).Effect of safflower oil emulsion on lipid lowing.Chin J New Drug，2003，12(2):111.

2 Zhang YR(張艷榮)，Zhang YY(張雅媛)，Li Y(李玉).Anti-thrombosis action of Agaricus blazei Murrill ω-6 polyunsaturated fatty acid on rats and mice.J Jilin Univ(Med Ed)，2006，32:774-776.

3 Xu ZH(徐章華)，Shao YF(邵玉芬).Effects of α-linolenic acid on rats`behavior，retina and liver，brain fatty acid composition.China Public health，2002，18:301-303.

4 Mandem akers W，Morais VA，De Strooper B.A cell biological perspective on mitochondrial dysfunction in Parkinson disease and other neurodegenerative disease.J Cell Sci，2007，(10):1707-1716.

5 Chalon S，Vancassel S，Zimmer L，et al.Polyunsaturated fatty acids and cerebral function:focus on monoaminergic neurotransmission.Lipids，2001，36:937-944.

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Preventive Effect of Different ω-3/ω-6 Constituent Ratio of Compatibility Safflower Seed Oil on SH-SY5Y Cells against Oxidative Cell Damage

WU Di1，WU Gui-rong1，Abulizi ABUDULA2，SHENG Lei2，Bahaerguli KAHAER1*1Department of Pharmacochemistry and Organic Chemistry，College of Pharmacy，Medical University of Xinjiang;2Xinjiang Key Laboratory of Molecular Biology and Endemic Diseases，College of Preclinical Medicine，Medical University of Xinjiang，Urumqi 830011，China

In order to investigate the preventive effect of different ω-3/ω-6 constituent ratio of compatibility safflower seed oil(CSSO)on SH-SY5Y human neuroblastoma cells against oxidative cell damage，an oxidative cell damage model was established by using hydrogen peroxide(H2O2)as a donor of free reactive oxygen species，and after treatment of cells with different ω-3/ω-6 constituent ratios of CSSO，the alteration of cell viability and cellular apoptosis were determined by MTT(methyl thiazolyl tetrazolium)assay and flow cytometry.We successfully established the oxidative cell damage model of SH-SY5Y cells induced by H2O2，with the IC50value of 1089.54 μmol/L H2O2.The preventive effect of CSSO against oxidative cell damage increased along with the decreasing amount of ω-3 content in CSSO.Moreover，at the ω-3/ω-6 ratio of 1:6.68 and effective dose range of 375-750 μg/mL CSSO，the cell viability was increased significantly to a higher level in the treatment group(84.1%)than in the control(61.1%)，and cellular apoptosis was decreased markedly to a lower level(12.6%)in treatment group than in the control(25.9%).The results suggested that CSSO was able to protect the cells and prevent from oxidative cell damage caused by reactive oxygen species，and this effect may be closely associated with the ω-3/ω-6 constituent ratio in CSSO.

compatibility safflower seed oil;oxidative damage;SH-SY5Y;MTT

1001-6880(2011)03-0420-05

2010-06-22 接受日期:2010-12-06

新疆維吾爾自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基金項(xiàng)目(XJDX0208-2006-07)

*通訊作者 Tel:86-991-4362470;E-mail:bahaerguli_k@126.com

Q946.91;R285

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