任紅榮，單承鶯，姜洪芳，張衛(wèi)明*

1南京師范大學生命科學學院，南京210097;2南京野生植物綜合利用研究院，南京210042

香水蓮花提取物抑制酪氨酸酶活性的研究

任紅榮1，2，單承鶯2，姜洪芳1，2，張衛(wèi)明1，2*

1南京師范大學生命科學學院，南京210097;2南京野生植物綜合利用研究院，南京210042

本實驗以L-酪氨酸為底物，從馬鈴薯中提取酪氨酸酶，以熊果苷為陽性對照，采用比色法測定了香水蓮花醇提物、水提物及總黃酮提取物對酪氨酸酶的抑制率，以探討香水蓮花醇提物、水提物及總黃酮提取物對酪氨酸酶的活性的抑制作用。結果表明，三種提取物對酪氨酸酶活性的抑制效果從高到低依次為總黃酮提取物、醇提物、水提物，說明其有效成分為醇溶性物質;總黃酮提取物對酪氨酸酶活性的抑制效果明顯高于醇提物和水提物對酪氨酸酶活性的抑制效果，可以考慮將其作為一種新型的植物源美白劑，應用于化妝品行業(yè)。

香水蓮花;醇提物;水提物;總黃酮;酪氨酸酶;抑制作用

酪氨酸酶(Tyrosinase，TYR)(EC.1.14.8.1)又稱多酚氧化酶，廣泛存在于植物、動物和微生物體內。它是一種含銅的氧化還原酶，參與黑色素合成的前兩步反應，是黑色素合成的限速酶［1］，不僅決定黑素合成的速率，還是黑素細胞分化成熟的特征性標志［2］.酪氨酸酶的活性與黑素合成量相關，控制其活力即可控制黑素生成量［3］。

在人體中，酪氨酸酶則主要存在于皮膚表皮細胞的黑色素細胞中，與一些常見皮膚疾病如雀斑、黃褐斑、老年斑等色素障礙性疾病及惡性黑色素瘤的發(fā)生具有重要關系［4］。因此，酪氨酸酶抑制劑也被作為具有美白作用的添加劑添加到化妝品中，如熊果苷和曲酸可被作為化妝品中的美白劑，改善皮膚中色素細胞的酪氨酸酶的代謝，阻止色素沉著［5］。天然產物化妝品，特別是添加了中草藥有效活性成分的化妝品的開發(fā)越來越受到國內外廠商的重視，也深受消費者的青睞，具有很大的市場潛力［6］。

香水蓮花(Nymphaea Hybrid)是睡蓮科Nymphaea水生宿根草本植物，屬于大型睡蓮類，既是重要的園林觀賞花卉，又是生產切花的新興品種［7］，以香水蓮花焙制的茶風味獨特。已有的研究表明含有揮發(fā)油、多糖、黃酮、鞣質等多種活性物質，香水蓮花的降血脂作用已經在動物實驗中得到證實［8］，并具有一定的體外抗氧化活性。

近年來，從植物中分離天然酪氨酸酶抑制劑已得到人們的普遍關注［9-13］。因此，本實驗以L-酪氨酸為底物，從馬鈴薯中提取酪氨酸酶，以熊果苷為陽性對照，研究了香水蓮花提取物對酪氨酸酶活性的影響，以尋求新型高效的天然美白劑和進一步提高香水蓮花的利用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

香水蓮花帶雄蕊的干燥花托:浙江省溫州市三心美德投資有限公司提供。七月采摘，剝去萼片和花瓣，貼近花托基部切去花梗，鼓風干燥。

新鮮馬鈴薯，購自南京市華潤蘇果超市。

1.2 試劑

L-酪氨酸(L-Tyrosine，Sigma公司);熊果苷(北京貝利萊斯生物化學有限公司);95%乙醇，二甲基亞砜(DMSO)，磷酸，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉，濃鹽酸，均為市售分析純;實驗用水為去離子水。

1.3 儀器

組織搗碎機(型號JJ-2，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司);紫外可見分光光度計(型號T6新世界，北京普析通用儀器有限公司);離心機(型號80-1，上海手術器械廠);數(shù)顯恒溫水浴鍋(型號HH-4，金壇市江南儀器廠)。

1.4 方法

1.4.1 試劑配制

1.4.1.1 磷酸鈉緩沖液(1/15M，pH=6.8)

精確稱取1.0001 g磷酸二氫鈉，1.1860 g磷酸氫二鈉，加入少量去離子水溶解后，定容至500 mL，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.1.2 L-酪氨酸溶液(7.5 mmol/L)

精確稱取L-酪氨酸0.2721 g，先加入數(shù)滴濃鹽酸，加去離子水約50 mL，微熱完全溶解后，用氫氧化鈉溶液調pH至7.0，加去離子水定容至200 mL。

1.4.1.3 受試液

精確稱取香水蓮花醇提物、水提物及黃酮各項各0.1001 g，分別溶于20 mL二甲基亞砜，得到5 mg/mL的待測液，再對倍稀釋到2.5、1.25、0.625、0.3125 mg/mL和0.15625 mg/mL。

1.4.1.4 陽性對照(+CK)

精確稱取0.1002 g熊果苷粉末，溶于20 mL的去離子水中，得到5.01 mg/mL的陽性對照母液，再對倍稀釋到2.5、1.2500、0.6250、0.3125 mg/mL和0.1562 mg/mL。

1.4.2 材料的制備

1.4.2.1 香水蓮花醇提物的制備:分別稱取雄蕊、花托和帶雄蕊花托各10 g，用80%的乙醇熱回流提取2次，每次3 h。提取液抽濾后合并，減壓濃縮后真空干燥，得各項醇提物。

1.4.2.2 香水蓮花水提物的制備:分別稱取雄蕊、花托和帶雄蕊花托各10 g，用蒸餾水于90℃提取2次，每次3 h。提取液抽濾后合并，減壓濃縮后真空干燥，得各項水提物。

1.4.2.3 香水蓮花雄蕊總黃酮的制備:稱取雄蕊10 g，石油醚脫脂兩次，每次2 h，過濾。濾渣烘干后用75%的乙醇熱回流提取兩次，每次3 h。提取液抽濾后合并，減壓濃縮后部分進行真空干燥，得總黃酮提取物;另一部分濃縮到料液比為1∶2，用HPD-400大孔樹脂分離，洗脫劑分別為30%和60%乙醇。洗脫液減壓濃縮后真空干燥，得30%流份和60%流份。

1.4.3 酪氨酸酶液的制備

以新鮮完好的馬鈴薯制取酪氨酸酶液，具體操作為:

將馬鈴薯洗凈，于4℃預冷4 h左右。去皮，切成約1×1×1 cm3丁狀，于-20℃冷凍過夜。稱重，按1∶1(w∶v)的比例加入4℃預冷的磷酸鈉緩沖液，用組織搗碎機制成勻漿，3層紗布過濾，濾液于4000 r/min離心10 min，上清即為所得的酪氨酸酶粗酶液，4℃保存，2 h內用完。

1.4.4 黃酮含量的測定

1.4.4.1 標準品溶液的配置

精密稱取105℃常壓干燥至恒重的蘆丁10.3 mg，以75%乙醇為溶劑，定容至50 mL容量瓶中，配置成0.206 mg/mL的蘆丁標準品溶液。

1.4.4.2 樣品溶液的配置

精密稱取由1.4.2.3方法得到的30%流份、60%流份干燥物0.0201 g，以75%的乙醇為溶劑，定容到50 mL的容量瓶中，配置成0.4 mg/mL的樣品溶液。

1.4.4.3 測定波長的確定

采用三氯化鋁顯色法確定香水蓮花總黃酮測定的波長。分別吸取標準品溶液和樣品溶液0.1 mL，以75%的乙醇為溶劑，定容至10 mL的容量瓶中，分別吸取2 mL，加2 mL 1%三氯化鋁顯色10 min后在200～600 nm波長范圍內掃描，均以1%三氯化鋁為空白對照。

1.4.4.4 標準曲線繪制的方法

精密稱取105℃常壓干燥至恒重的蘆丁20 mg，用75%的乙醇定容至100 mL作為母液。精密量取蘆丁標準品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，用75%的乙醇定容。分別吸取2 mL蘆丁標準液加2 mL1%三氯化鋁顯色10 min后，以樣品溶液作為空白對照，在波長425 nm處測定吸光度值。以蘆丁量為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制標準曲線。

1.4.5 樣品對酪氨酸酶活性的抑制

總反應體系為5mL。具體設計見“表1”。其中，用分光光度計測量吸光值時，“受試液”、“標準對照”、“陽性對照”分別以“陰性對照1”、“陰性對照2”和“陰性對照3”調零。

表1 5 mL試驗體系設計Table 1 The design of the 5 mL test system

在此體系中，受試液(包括陽性對照熊果苷)的終濃度(mg/mL)梯度為0.03125、0.0625、0.125、0.25和0.5。

實驗時，向試管中依次加入磷酸鹽緩沖液、不同濃度梯度的受試液(包括陽性對照)和酶液，于30℃水浴10 min。然后加入底物L-酪氨酸，立即開始計時。測定反應20 min時475 nm波長下的吸光值。測定時以相應的陰性對照為參比，用下列公式計算受試液(包括陽性對照)對酪氨酸酶的抑制率，并依據(jù)濃度-酶抑制率曲線估算半數(shù)抑制濃度( IC50)的近似值。

其中，“A”為標準對照的吸光值，“B”為受試液(或陽性對照)的吸光值.

每個實驗做3個平行。抑制率高表明其對酪氨酸酶活性的抑制強度高。

2 結果與分析

2.1 黃酮含量的測定

2.1.1 測定波長的確定

經紫外光譜分析，蘆丁標準溶液在425 nm處有最大吸收，樣品在425 nm處接近最大吸收。因此選擇425 nm作為黃酮含量的測定波長。

2.1.2 蘆丁標準曲線

根據(jù)“1.4.4.4”中的方法繪制的蘆丁標準曲線，求得到回歸方程:y=0.0251x+0.0092;R2= 0.9992，表明蘆丁在本是實驗涉及的濃度范圍4～40 μg/mL范圍內呈良好線性關系。

表2 香水蓮花各提取物的黃酮含量Table 2 The contents of flavonoids in Nymphaea Hybrid

2.1.3 黃酮含量測定結果

2.2 香水蓮花提取物對酪氨酸酶的抑制作用結果

2.2.1 香水蓮花總醇提物、花托醇提物、雄蕊醇提物及熊果苷對酪氨酸酶的抑制作用如圖1所示:

圖1 香水蓮花各醇提物對酪氨酸酶的抑制作用Fig.1 Inhibitory of ethanol extract from the flower of N.hybrid and arbutin on the activity of tyrosinase

2.2.2 香水蓮花總水提物、花托水提物、雄蕊水提物及熊果苷對酪氨酸酶的抑制作用如圖2所示:

圖2 香水蓮花各水提物對酪氨酸酶的抑制作用Fig.2 Ihibitory of the aqueous extract from the flower of N.hybrid and arbutin on the activity of tyrosinase

2.2.3 香水蓮花雄蕊總黃酮、30%流份、60%流份及熊果苷對酪氨酸酶的抑制作用如圖3所示:

圖3 香水蓮花各黃酮提取物對酪氨酸酶的抑制作用Fig.3 Ihibitory of the flavone extract from the flower of N.hybrid and arbutin on the activity of tyrosinase

由圖1可以看出，在實驗濃度范圍內，隨著樣品濃度的升高，各項樣品對酪氨酸酶的抑制率呈上升趨勢，均表現(xiàn)為劑量依賴性抑制。其中香水蓮花花托和雄蕊醇提物對酪氨酸酶的抑制作用明顯強于同濃度的陽性對照熊果苷對酪氨酸酶的抑制作用，而總醇提物對酪氨酸酶的抑制作用稍弱，大致與熊果苷對酪氨酸酶的抑制作用相當。由圖1可比較出各項醇提物及熊果苷的IC50值(半數(shù)抑制濃度)大小，依次為IC50值(香水蓮花花托醇提物)＜IC50值(香水蓮花熊蕊醇提物)＜IC50值(熊果苷)＜IC50值(香水蓮花總醇提物)。

由圖2可以看出，在實驗濃度范圍內，香水蓮花不同部位水提物的抑制率均未達到50%，且均低于熊果苷的抑制率，是由于香水蓮花的水提物中能夠抑制酪氨酸酶的有效物質很少，只出現(xiàn)了較弱的酪氨酸酶抑制活性。

由圖3可以看出，在實驗濃度范圍內，各項黃酮物質對酪氨酸酶的抑制率均很高，且均高于熊果苷的抑制率?？傸S酮的抑制率一直處于平緩增加的趨勢，30%流份的抑制率有明顯的升高，60%流份當濃度大于0.625 mg/mL，處于緩慢增加的趨勢。

由表2可看出，同種提取溶劑中，雄蕊提取物的黃酮含量均比花托提取物高，并有資料顯示，黃酮類物質對酪氨酸酶的活性有比較強的抑制作用，提示了黃酮類物質可通過抑制酪氨酸酶活性而達到美白之功效［14］。但是各項提取物中，花托提取物對酪氨酸酶的抑制率均比雄蕊提取物對酪氨酸酶的抑制率高。這是由于花托的總酚和鞣質的含量比雄蕊的總酚和鞣質的含量高:花托總酚含量為8.613%，雄蕊總酚含量為7.696%;花托鞣質含量為5.703%，雄蕊鞣質含量為3.163%，據(jù)文獻報道，多酚［15］及鞣質［16］均有抑制酪氨酸酶活性。因此香水蓮花抑制酪氨酸酶活性的物質基礎應為總黃酮、多酚及鞣質類。

熊果苷(β-Arbutin，化學名為4-羥苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷)是Akiu等于1988年從杜鵑花科植物熊果(Arctostap hylosuva-ursi(L.)Spreng.)果實中分離到的。它是酪氨酸酶的競爭性抑制劑，可有效地抑制皮膚中的酪氨酸酶活性，阻斷黑色素的生成，減少皮膚色素沉積，祛除色斑和雀斑，而且對黑色素細胞不產生毒害性，刺激性、致敏性等副作用，使用安全性很高［17］。因此本試驗選擇熊果苷作為陽性對照，無疑能夠對香水蓮花醇提物的酪氨酸酶活性抑制作用作出更具說服力的客觀評價。

酪氨酸酶同時具有單酚酶活性(以酪氨酸為底物)和二酚酶活性(以多巴為底物)［18］。酪氨酸酶的活性與黑色素的生成有密切的關系。在機體內它能將L-酪氨酸(L-Tyrosine，L-Tyr)羥化，產生鄰位二羥基苯丙氨酸(L-多巴，L-DOPA)，再將多巴氧化成多巴醌，進而生成一系列能引起褐化的色素類物質［19］。酪氨酸酶抑制劑可用來預防和治療色素沉著和黑色素瘤等疾病。目前，氫醌、果酸、維生素C、曲酸和熊果苷等酪氨酸酶抑制劑已作為美白劑應用于化妝品中，但氫醌、果酸由于刺激性大已逐漸被淘汰;維生素C、曲酸易氧化，保質期短。因此，尋求新型的生物美白劑已成為當今美白化妝品的發(fā)展方向。

本實驗結果表明，香水蓮花提取物不僅對酪氨酸酶活性具有抑制作用，并且對酪氨酸酶活性的抑制效率呈劑量依賴性關系，隨著香水蓮花提取物濃度的增加其對酪氨酸酶活性的抑制效率也逐步增加。

3 結論

本實驗證明香水蓮花總黃酮對黑色素形成具有明顯的抑制效率。因此，香水蓮花黃酮提取物作為一種新型的植物源美白劑，配入各種霜膏中，可制成保護皮膚、抗衰老和祛斑的功能性化妝品，在藥用和化妝品行業(yè)具有良好的開發(fā)應用前景。

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Inhibition of the Extract from Nymphaea Hybrid on the Activity of Tyrosinase

REN Hong-rong1，2，SHAN Cheng-ying2，JIANG Hong-fang1，2，ZHANG Wei-ming1，2*1School of Life Science，Nanjing Normal University，Nanjing，210097，China;2Nanjing Institute for the Comprehensive Utilization of Wild Plant，Nanjing，210042，China

This study aimed to investigate the Nymphaea Hybrid inhibition performances of an alcohol extract，a total flavone extract and an aqueous extract.The inhibition rates of these three kinds of extracts on tyrosinase were tested by the colorimetry method using the L-tyrosine as the substrate and arbutin as a positive control.The results showed that the N.hybrid inhibition function of these extracts followed the order:the total flavone extract＞alcohol extract＞the queous extract.This suggested that the active component of inhibition function was alcohol-soluble.Therefore，N.hybrid could be considered as a new kind of botanical whitening agent and thus be applied to cosmetic industry.

Nymphaea Hybrid;alcohol extract;aqueous extract;total flavone;tyrosinase;inhibition

1001-6880(2011)06-1122-05

2010-03-04 接受日期:2010-08-31

國家“十一五”支撐計劃課題(2006BADO6B05)

*通訊作者 Tel:86-25-85413696;E-mail:botanyzh@163.com

R284.2

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