常明泉，黃良永，葉立紅，袁勝浩，安志斌，王剛（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院，十堰市442000）

槲皮素固體脂質(zhì)納米粒的包封率與載藥量測定Δ

常明泉＊，黃良永，葉立紅，袁勝浩，安志斌，王剛#（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院，十堰市442000）

目的：建立槲皮素固體脂質(zhì)納米粒（SLN）的包封率和載藥量測定方法。方法：采用高速離心-高效液相色譜法。色譜柱為DiamonsiL-C18（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇-4.3%乙酸溶液（55∶45），流速為1.0mL·min-1，檢測波長為254nm，柱溫為30℃。結(jié)果：槲皮素檢測濃度在2.0～200.0μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系（r＝0.9996）；平均回收率為97.83%，RSD＝1.03%（n＝6）。該條件下，槲皮素SLN的包封率為80.2%，載藥量為1.7%。結(jié)論：所建方法便捷、可靠，可用于SLN包封率與載藥量的測定。

槲皮素；固體脂質(zhì)納米粒；包封率；載藥量

槲皮素是一種天然黃酮類化合物，它在一些植物藥如蘆丁、槐米、紅棗、桑葉、三七中以苷的形式存在；它通過細(xì)胞增殖和血管新生相關(guān)信號(hào)通路的復(fù)雜作用而對(duì)腫瘤表現(xiàn)出化學(xué)預(yù)防作用[1]。固體脂質(zhì)納米粒具有細(xì)胞親和性、靶向性、緩釋性、低毒性和穩(wěn)定性的特點(diǎn)，藥物制成脂質(zhì)體可大大提高生物利用度[2]。槲皮素固體脂質(zhì)納米粒是十堰市武當(dāng)中醫(yī)藥研究所研制的一種抗癌新制劑，為了更好地發(fā)揮槲皮素的藥理作用，控制制劑質(zhì)量，筆者擬用高速離心機(jī)和高效液相色譜（HPLC）法對(duì)其包封率和載藥量進(jìn)行測定。

1 儀器與試藥

TGL-16G離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市英峪子華儀器制造廠）；UPS-200H型超聲波震蕩儀（功率：500W，工作頻率：50Hz，南京熊貓電子儀器有限公司）；3000型HPLC儀（美國戴安公司）。

槲皮素對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100081-200406）；槲皮素原料（十堰市武當(dāng)中醫(yī)藥研究所，批號(hào)：20100414）；山崳酸甘油酯、大豆卵磷脂、膽固醇、泊洛沙姆、聚乙二醇2000（武漢祥和精細(xì)化工有限公司，批號(hào)分別為100305、100310、100305、100315、100307）；丙酮（武漢市江北化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20080407）；氯仿（洛陽化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20080224）；吐溫80（上海化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20081006）；無水乙醇（武漢市洪山中南化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20091106）；甲醇、乙酸均為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 槲皮素固體脂質(zhì)納米粒的制備[3]

分別稱取山崳酸甘油酯0.1g、膽固醇0.1g、大豆卵磷脂0.2g置適宜燒杯中，于80℃水浴中熔融作為油相；稱取丙酮6mL、氯仿6mL混勻，再稱取槲皮素20mg加入丙酮-氯仿混合液中混合溶解作為有機(jī)相；將有機(jī)相與油相混合均勻，保溫75℃；稱取泊洛沙姆0.1g、聚乙二醇20000.1g、吐溫801mL、純化水13mL置適宜燒杯中，于75℃水浴上加熱溶解作為水相；在磁力攪拌狀態(tài)下（600r·min-1）用帶有6號(hào)針頭的適宜注射器吸取油相緩緩注入水相中（2mL·min-1），繼續(xù)攪拌120min乳化包封，至濃縮到原體積的1/2時(shí)，將燒杯移入另一盛有2℃冰水的磁力攪拌器中，加入13mL約2℃的冰水，繼續(xù)攪拌固化60min，即得。

2.2 槲皮素固體脂質(zhì)納米粒包封率與載藥量測定

2.2.1 色譜條件色譜柱：DiamonsiL-C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-4.3%乙酸溶液（55∶45）；流速：1.0mL·min-1；檢測波長：254nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μL[4～7]。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取于105℃減壓干燥至恒重的槲皮素對(duì)照品2.0mg，加無水乙醇超聲溶解，定容至10mL的容量瓶中，即得。

2.2.3 樣品溶液的制備 （1）樣品溶液A的制備：取槲皮素固體脂質(zhì)納米粒樣品1g，精密稱定，置50mL平底燒杯中，加無水乙醇約15mL超聲破乳分散均勻，溶液轉(zhuǎn)入50mL容量瓶中，洗滌燒杯3次（10、10、10mL），洗液并入容量瓶中，定容，搖勻，取混合溶液適量于離心機(jī)中以1.6×104r·min-1的速度離心15min，取上清液用0.45μm微孔濾膜過濾，即得。（2）樣品溶液B的制備：取同一批號(hào)樣品1g，加入15mL純化水，按上述方法用同體積的純化水處理樣品，即得。（3）陰性樣品溶液的制備：按樣品溶液A的方法精密稱取不含槲皮素的陰性樣品1g，加入無水乙醇照上述方法處理，即得。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別吸取槲皮素對(duì)照品溶液0.1、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL至10mL容量瓶中，用甲醇稀釋，即得2、40、80、120、160、200μg·mL-1的對(duì)照品溶液，精密吸取 20μ L進(jìn)樣，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，重復(fù)操作3次。以峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，檢測濃度（c）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y＝1.3435c－1.4904（r＝0.9996，n＝6）。結(jié)果表明，槲皮素檢測濃度在2.0～200.0μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別吸取對(duì)照品溶液和各樣品溶液適量，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。結(jié)果，對(duì)照品溶液、樣品溶液A、樣品溶液B均在相同位置有吸收峰出現(xiàn)，陰性樣品溶液則無吸收，說明其他輔料對(duì)槲皮素測定不產(chǎn)生干擾。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.對(duì)照品；B.樣品溶液A；C.樣品溶液B；D.陰性樣品溶液；1.槲皮素Fig 1 HPLC chromatogramsA.substance control；B.sample solution A；C.sample solution B；D.negative sample solution；1.quercetin

2.2.6 精密度試驗(yàn) 取濃度為80μg·mL-1的對(duì)照品溶液適量，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣5次，測定槲皮素的峰面積。結(jié)果，RSD＝1.12%（n＝5），表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取取已知含量的樣品溶液適量，于溫度為5～10℃的冰箱中保存，分別于0、4、12、24、36、48h取樣，進(jìn)樣測定槲皮素的含量。結(jié)果，RSD＝1.62%（n＝6），表明供試品溶液在48h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已測知含量的槲皮素固體脂質(zhì)納米粒樣品6份，每份0.5g，精密稱定，分別加入濃度為80.0μg·mL-1的對(duì)照品溶液1mL，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測定槲皮素的含量，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，平均回收率為97.83%，RSD＝1.03%（n＝6）。

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 平行稱取6份樣品，各1g，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，照上述色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果，RSD＝1.80%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.2.10 包封率的測定 在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下，分別對(duì)樣品溶液A和樣品溶液B進(jìn)樣測定槲皮素的含量，可以計(jì)算出納米粒中槲皮素的總量和游離槲皮素的量，按下式計(jì)算出納米粒的包封率：包封率＝（W總－W游）/W總×100%（式中，W總為脂質(zhì)體中槲皮素總量；W游為脂質(zhì)體中未被包封的游離槲皮素量）。測得該制劑包封率為80.2%。

2.2.11 載藥量的測定 按上述方法，分別測定出樣品溶液A和樣品溶液B中槲皮素的含量，按下式計(jì)算載藥量：載藥量＝（W包－W游/V總重）×100%（式中，V總重為納米粒取樣量；W包為脂質(zhì)體中被包封的槲皮素量；W游同前）。測得該制劑的載藥量為1.7%。

3 討論

本試驗(yàn)采用乳化蒸發(fā)-低溫固化法制備槲皮素固體脂質(zhì)納米粒，主藥槲皮素不溶于水，先將其加入丙酮-氯仿（1∶1）組成的有機(jī)相中溶解后再加入油相中混合，加入2.5%的吐溫80作乳化劑，以山崳酸甘油酯、膽固醇為載體材料，乳化溫度控制在75℃，乳化和固化時(shí)攪拌器轉(zhuǎn)速均控制在600r·min-1，制得的脂質(zhì)納米粒穩(wěn)定性好，并有較高的包封率。

本試驗(yàn)采用高速離心-HPLC法測定固體脂質(zhì)納米粒的包封率和載藥量，在處理樣品溶液A時(shí)，加入無水乙醇超聲不僅能夠破乳而且使槲皮素被乙醇充分溶解；處理樣品溶液B時(shí)，在樣品中加入純化水，超聲分散、洗脫未被包封的槲皮素，超聲時(shí)間應(yīng)控制在15～30min內(nèi)，時(shí)間過久超聲波的空化效應(yīng)由于對(duì)粒子的粉碎作用會(huì)使納米粒中的槲皮素破乳而游離，影響測定結(jié)果。

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Determination of Drug-loading Rate and Encapsulation Efficiency of Quercetin Solid Lipid Nanoparticles

CHANG Ming-quan，HUANG Liang-yong，YE Li-hong，YUAN Sheng-hao，AN Zhi-bin，WANG Gang（Taihe Hospital of Hubei University of Medicine，Shiyan 442000，China）

OBJECTIVE：To establish the determination method of the drug-loading rate and encapsulation efficiency of Quercetin solid lipid nanoparticles（QUE-SLNs）.METHODS：A high-velocity centrifuge-HPLC was adopted.The determination was performed on DiamonsiL-C18（250mm×4.6mm，5μm）column with mobile phase consisted of methanol-4.3%acetic acid solution（55∶45）at flow rate of 1.0mL·min-1.The detection wavelength was set at 254nm and column temperature was 30℃.RESULTS：The linear range of quercetin was 2.0～200.0μg·mL-1（r＝0.9996）with an average recovery of 97.83%（RSD＝1.03%，n＝6）.The encapsulation efficiency of QUE-SLNs was 80.2%and the drug-loading rate was 1.7%.CONCLUSION：The method is simple，convenient and reliable.It can be used for the determination of drug-loading rate and encapsulation efficiency of SLN.

Quercetin；Solid lipid nanoparticles；Encapsulation efficiency；Drug-loading rate

R284.2；R283.62

A

1001-0408（2011）27-2525-02

Δ湖北省教育廳科研項(xiàng)目（Q20102110）

＊主管藥師。研究方向：藥物制劑。電話：0719-8801103。E-mail：cmqman@yahoo.com.cn

#通訊作者：副主任藥師，博士。研究方向：中藥藥理。E-mail：wangan139@163.com

2010-11-03

2011-04-10）