謝 斌, 孟麗麗, 肖義軍, 楊昊宇, 鄧寶玲, 向 順, 匡永清

(1. 湖南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,湖南 長沙 410082; 2. 福建師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,福建 福州 350108)

青蒿素是從菊花科植物黃花蒿中分離得到的一種高效抗瘧活性成分，其衍生物雙氫青蒿素(2),蒿甲醚及青蒿琥酯(3)等亦被廣泛用于各類瘧疾的治療。研究表明，青蒿素及其衍生物除具有抗瘧作用外，還呈現(xiàn)較強(qiáng)的腫瘤抑制活性[1～4]。為了降低毒性，增強(qiáng)抗腫瘤活性，國內(nèi)外先后合成、篩選了多種新結(jié)構(gòu)類型的青蒿素衍生物[5～7]。基于青蒿素的靶向藥物及拼合藥物也成了新的研究熱點(diǎn)[8～10]。一氧化氮(NO)供體可通過靶向釋放NO，直接殺傷腫瘤細(xì)胞；或通過改善乏氧細(xì)胞內(nèi)氧的分布和利用，提高腫瘤細(xì)胞對放化療的敏感性；此外還可增強(qiáng)機(jī)體免疫系統(tǒng)作用，削弱腫瘤細(xì)胞侵襲能力，并抑制其轉(zhuǎn)移，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[11]。將NO供體與具有抗腫瘤活性的藥物拼合可顯著增強(qiáng)其抗腫瘤活性[12，13]。單硝酸異山梨酯(4)是一種有機(jī)硝酸酯類的NO供體，臨床主要用于心絞痛的治療，并可通過多種機(jī)制增加腫瘤對化放療的敏感性，并可在一定程度上抑制腫瘤增殖及預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移[11]。

本文報(bào)道青蒿素經(jīng)硼氫化鈉還原制得2;2在4-二甲氨基吡啶(DMAP)催化下與丁二酸酐反應(yīng)得到3;以二環(huán)己基碳二亞胺為脫水劑，DMAP為催化劑，將3與一氧化氮供體單硝酸異山梨酯反應(yīng)合成了雙氫青蒿素-單硝酸異山梨酯拼合物(1, Scheme 1),其結(jié)構(gòu)經(jīng)NMR和MS表征。并對其體外抗腫瘤活性進(jìn)行了初步研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 儀器與試劑

YRT-3型數(shù)字熔點(diǎn)儀；JASCO P-1010型旋光儀；Fax-2100型酶標(biāo)儀;Varian INOVA-400型核磁共振儀(CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo))。

青蒿素，西安天行健天然生物制品有限公司；4，北京盛仁堂醫(yī)藥有限公司，用前提取純化；四氮唑鹽(MTT)， Sigma公司；其余所用試劑均為國產(chǎn)分析純或化學(xué)純。

細(xì)胞株：人Burkitt淋巴瘤細(xì)胞株CA46,人T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株Molt4及小鼠淋巴瘤細(xì)胞株P(guān)388由福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院福建省血液病研究所惠贈(zèng),用含l0%胎牛血清的RPMI1640(Gibco公司)培養(yǎng)液，置37 ℃, 5%CO2, 飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2天～3天換液傳代1次。取生長良好的對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

Scheme 1

1．2 合成

(1)2的合成

(2)3的合成

(3)1的合成

1．3 用MTT法測定1的體外抗腫瘤活性

以青蒿素和2為對照品，用MTT法測定1的體外抗腫瘤活性。DMSO作溶劑，配制c為100 mmol·L-1的藥液，用無血清1640培養(yǎng)液倍比稀釋配成梯度溶液：8, 4, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.062 5 μmol·L-1；將細(xì)胞分別接種于96孔培養(yǎng)板，每孔180 μL， 2.5×104個(gè)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組每孔加藥液20 μL，陰性對照組加入含相同體積分?jǐn)?shù)DMSO的無血清培養(yǎng)液,每組4個(gè)復(fù)孔。孵育48 h后，加入5 mg·mL-1的MTT 20 μL，于37 ℃孵育4 h后離心(2 000 rpm, 10 min)，小心吸去上清，加入150 μL DMSO,振蕩3 min～5 min，置酶標(biāo)儀上用492 nm和630 nm雙波長測吸光度值A(chǔ)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值計(jì)算腫瘤細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-用藥組平均A值/對照組平均A值)×100%，用LOGIT法計(jì)算藥物的IC50值[18]。

2 結(jié)果與討論

2.1 1的合成

按照文獻(xiàn)[10]方法合成的2為α-和β-兩種差向異構(gòu)體的混合物，由1H NMR判斷其比例接近1 ∶1。但3為單一α-構(gòu)型。其原因是在溶液中2的兩種差向異構(gòu)體之間存在動(dòng)態(tài)平衡，而在DMAP催化下2與丁二酸酐反應(yīng)時(shí)，α-構(gòu)型優(yōu)先轉(zhuǎn)化為3[17]。由于2結(jié)構(gòu)中含有敏感基團(tuán)，在強(qiáng)酸或強(qiáng)堿條件下很不穩(wěn)定，因此制備1不能采用常規(guī)的酸催化酯化反應(yīng)，而必須選擇溫和的反應(yīng)條件。本實(shí)驗(yàn)采用DCC/DMAP體系輔助酯化，在室溫下方便地制得目標(biāo)產(chǎn)物。

2.2 1的體外抗腫瘤活性

表1 1的體外抗腫瘤活性*

*測試方法見1.3

用MTT法測定青蒿素,1和2的體外抗腫瘤活性，結(jié)果見表1。從表1可以看出，1對CA46, Molt4和P388的增殖均有明顯的抑制作用，其IC50值分別為0.024 mg·L-1, 0.076 mg·L-1和0.105 mg·L-1。這說明1的抑制作用明顯優(yōu)于青蒿素和2。這一結(jié)果提示一氧化氮供體對青蒿素衍生物的抗腫瘤活性具有一定增效作用。

[1] Michaelis M, Kleinschmidt M C, Barth S,etal. Anti-cancer effects of artesunate in a panel of chemoresistant neuroblastoma cell lines[J].Biochem Pharmacol,2010,79(2):130-136.

[2] 李天星,姚朗. 青蒿素類藥物抗腫瘤作用的基礎(chǔ)與臨床研究[J].中國新藥與臨床雜志,2008,27(3):227-230.

[3] Hou J, Wang D, Zhang R,etal. Experimental therapy of hepatoma with artemisinin and its derivatives:In vitro and in vivo activity,chemosensitization,and mechanisms of action[J].Clin Cancer Res,2008,14:5519-30.

[4] Jung M, Lee K, Kim H,etal. Recent advances in artemisinin and its derivatives as antimalarial and antitumour agents[J].Current Med Chem 2004,11(10):1265-1284.

[5] Slade D, Galal A M, Gul W,etal. Antiprotozoal, anticancer and antimicrobial acetal dimers and monomers[J].Bioorganic & Medicinal Chemistry,2009,17(23):7949-7957.

[6] Cho S, Oh S, Uma Y,etal. Synthesis of 10-substituted triazolyl artemisinins possessing anticancer activity via huisgen 1,3-dipolar cylcoaddition[J].Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters,2009,19(2):382-385.

[7] Paik I H, Xie S, Shapiro T A,etal. Second generation,orally active,antimalarial,artemisinin-derived trioxane dimmers with high stability, efficacy, and anticancer activity[J].J Med Chem,2006,49(9):2731-2734.

[8] Lai H, Sasaki T, Singh N P. Targeted treatment of cancer with artemisinin and artemisinin-tagged iron-carrying compounds[J].Expert Opin Ther Targets,2005,9(5):995-1007.

[9] Michael Jones, Amy E Mercer, Paul A Stocks,etal. Antitumour and antimalarial activity of artemisinin-acridine hybrids[J].Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters,2009,19(7):2033-2037.

[10] 孟麗麗,匡永清,肖義軍,等. 二十二碳六烯酸雙氫青蒿素酯的合成及其抗腫瘤活性的初步研究[J].化學(xué)研究與應(yīng)用,2009,21(1):123-126.

[11] 陳穎,季暉,賴宜生. 一氧化氮供體型化合物的抗腫瘤作用研究進(jìn)[J].藥學(xué)進(jìn)展,2009,33(10):438-445.

[12] Huguenin S, Vacherot F, Fleury F J,etal. Evaluation of the antitumoral potential of different nitric oxide-donating non-steroidal anti-inflammatory drugs(NO-NSAIDs) on human urological tumor cell lines[J].Cancer Lett,2005,218(2):163-170.

[13] Moharram S, Zhou A, Wiebe L I,etal. Design and synthesis of 3′- and 5′-O-(3-benzenesulfonylfuroxan-4-yl)-2′-deoxyuridines:Biological evaluation as hybrid nitric oxide conor-nucleoside anticancer agents[J].J Med Chem,2004,47(7):1840-1846.

[14] Brossi A, Venugopalan B, Dominguez G L,etal. Arteether, a new antimalarial drug:Synthesis and antimalarial properties[J].J Med Chem 1998,31(3):645-650.

[15] 劉靜明,倪慕云,樊菊芬,等. 青蒿素的結(jié)構(gòu)和反應(yīng)[J].化學(xué)通報(bào),1979,37(2):129-140.

[16] Ognyanov I V, Konakchiev N, Hanni R. Process of the preparation of dihydroartemisinin hemisuccinate[P].US 005 654 446A,2005.

[17] Haynes R K, Chan H W, Chenung M K,etal. C-10 ester and ether derivatives of dihydroartemisinin-10βartesunate,preparation of authentic 10-βartesunate,and of other ester and ether derivatives bearing potential aromatic intercalating groups at C-10[J].Eur J Org Chem,2002,1:113-132.

[18] 劉昌孝,孫瑞元. 藥物評價(jià)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與統(tǒng)計(jì)學(xué)基礎(chǔ)[M].北京:軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社,1998.