孫化露，陳 冰，李樹純，陳素娟，彭大新

（揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州225009）

近年來鴨病呈逐漸增加的趨勢，其中病毒性疾病包括鴨流感、鴨新城疫、鴨病毒性肝炎、鴨細(xì)小病毒病、鴨呼腸孤病毒感染、鴨瘟等；細(xì)菌性疾病包括鴨疫里默氏桿菌病、大腸桿菌病、沙門菌病和禽霍亂等，這些病給養(yǎng)鴨業(yè)帶來了嚴(yán)重的危害。由于一些細(xì)菌為條件性致病菌，混合感染或繼發(fā)感染后會(huì)造成更大的損失；加之細(xì)菌易產(chǎn)生耐藥性，不同細(xì)菌之間可能存在耐藥基因的傳遞。因此，有必要對鴨病中可能存在的細(xì)菌種類做出鑒定。我們從病死鴨的臟器中分離鑒定出一些細(xì)菌，并通過16SrDNA序列分析來確定其種屬，探討了鴨病中可能存在的細(xì)菌感染。

1 材料與方法

1.1 試 劑 YEAST EXTRACT、TRYPTONE等，購自英國 OXOID公司；16SrDNA Bacterial Identification PCR Kit、Agarose Gel DNA Purification Kit，購自TaKaRa公司；pGEM－T Easy載體，購自Promega公司；細(xì)菌微量生化反應(yīng)管，購自杭州天和微生物試劑有限公司；麥康凱、瓊脂粉及其他試劑，購自國藥集團(tuán)。

1.2 病料采集與培養(yǎng) 從病死或?yàn)l臨死亡鴨子的心、肝、脾、腦等組織進(jìn)行無菌分離，分別接種于普通LB瓊脂、血清LB瓊脂（含5%～10%的小牛血清）和麥康凱等培養(yǎng)基，于需氧和厭氧條件（蠟燭培養(yǎng)罐）下，37℃溫箱中培養(yǎng)。18～24h記錄菌落大小、顏色、形態(tài)等。

1.3 染色與鏡檢 挑取純化后的單菌落，涂片后進(jìn)行革蘭染色，油鏡下觀察。

1.4 生化反應(yīng) 取分離菌的純培養(yǎng)物接種于微量生化反應(yīng)管，37℃溫箱中培養(yǎng)24h，記錄生化反應(yīng)結(jié)果［1］。

1.5 16SrDNA序列分析 采用煮沸裂解法制備細(xì)菌基因組DNA模板，取400μL過夜培養(yǎng)的菌液12 000r/min離心10min，沉淀用100μL滅菌超純水重懸，100℃水浴10min，置于冰上10min，12 000 r/min離心10min，取上清作為PCR模板；根據(jù)16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用Agarose Gel DNA Purification Kit回收純化陽性條帶，克隆至pGEM－T Easy載體，鑒定的陽性質(zhì)粒送南京金斯特科技有限公司進(jìn)行測序；將測定的序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST搜索比對，鑒定細(xì)菌種屬，采用MegAlign軟件進(jìn)行菌株同源性分析［2］。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)及染色特征 共篩選出7株細(xì)菌，分別命名為 D1001、D1002、D1003、D1004、D1005、D1006和D1007。其中D1001、D1004和D1007在麥康凱上均為白色濕潤菌落，且都可在普通LB上生長良好；D1002在麥康凱和普通LB中均生長良好，在麥康凱上培養(yǎng)的細(xì)菌在4℃冰箱放置一段時(shí)間后有水溶性淡綠色色素形成，且在普通LB生長的菌落有特殊的生姜?dú)馕?；D1003需要在血清LB中厭氧培養(yǎng)，在普通LB需氧條件下生長緩慢，4℃冰箱中放置3～4d，細(xì)菌極易死亡；D1005和D1006在普通LB嚴(yán)格需氧和嚴(yán)格厭氧條件下生長緩慢。

染色發(fā)現(xiàn)，D1001和D1007均為革蘭陰性直桿菌，散在或是成對存在；D1002和D1004均為革蘭陰性桿菌，形態(tài)相似，中等大小，單個(gè)或呈短鏈狀；D1003在普通LB中需氧條件下培養(yǎng)24h，涂片染色鏡檢為革蘭陰性、長絲狀菌，而在血清LB厭氧條件下培養(yǎng)后染色呈多形性。D1005為革蘭陽性菌，球狀至桿狀不等，形態(tài)多樣；D1006，涂片染色鏡檢為革蘭陽性球菌、呈四聯(lián)狀或成對排列。

2.2 生化特性 除D1003和D1004的生化特性模式一致外，其他的均有差異（表1）。

表1 分離菌株生化反應(yīng)特性

2.3 16SrDNA PCR擴(kuò)增及克隆結(jié)果 用16SrDNA試劑盒擴(kuò)增分離菌的16SrDNA片段后瓊脂糖凝膠電泳后紫外燈下觀察，在500bp左右有一條特異條帶；克隆至T載體后以EocRⅠ酶切，可見一條3 000bp的載體片段和一條500bp的目的條帶（圖1）。

圖1 分離株D1001 16SrDNA的PCR擴(kuò)增及T載體克隆

2.4 16SrDNA的序列測定及分析 將7種細(xì)菌的16SrDNA序列在NCBI上進(jìn)行BLAST搜索比對，其與GenBank中最接近細(xì)菌的同源性為96.8%～100%，因此可以確定這些細(xì)菌分別為大腸桿菌、銅綠假單胞菌、鴨疫里默氏菌、施氏假單胞菌、麥?zhǔn)习魲U菌、淺綠氣球菌和鼠傷寒沙門菌（表2）。其中鼠傷寒沙門菌分離菌與大腸桿菌的同源性為98.4%，銅綠假單胞菌與施氏假單胞菌的同源性為96.4%，7株分離菌的同源性最小為69.4%（圖2、圖3）。

3 討論

樣本中微生物的分離鑒定通常依賴于各種各樣的表型觀察，但由于有些表型不典型可能會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)果。目前出現(xiàn)了許多基于分子生物學(xué)技術(shù)的快速而直接的檢測微生物的方法，其中細(xì)菌的16S rDNA序列分析是目前較好的新方法之一，它已經(jīng)被廣泛使用［3］。16SrRNA分子大小適中，有足夠的遺傳信息用于分類研究［4－5］。16SrRNA基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析還能幫助我們認(rèn)識(shí)新的細(xì)菌，通過分析，可以計(jì)算出細(xì)菌種屬間的遺傳距離。本次分離的7種細(xì)菌分別為沙門菌、大腸桿菌、鴨疫里默氏菌、銅綠假單胞桿菌、施氏假單胞菌、淺綠氣球菌和麥?zhǔn)习魲U菌，與GenBank中最近的細(xì)菌菌株的同源性為96.8%～100%，因此可以快速確定細(xì)菌的種屬。

表2 分離菌16SrDNA基因序列比對鑒定結(jié)果

大腸桿菌、沙門菌、鴨疫里默氏菌是感染鴨的常見致病菌，既可與其他病毒性疾病造成混合感染或繼發(fā)感染，也可單獨(dú)感染或彼此混合感染，在臨床上易引起肝周炎、心包炎和腹膜炎。正常情況下大腸桿菌可在麥康凱上形成紅色菌落，極易與沙門菌相區(qū)別，但是有些不能發(fā)酵乳糖的大腸桿菌則需進(jìn)一步鑒定才能與沙門菌相區(qū)別。鴨疫里默氏菌雖然在含血清的培養(yǎng)基上厭氧條件下生長良好，但也可在LB瓊脂平板上生長，其涂片染色鏡檢呈長絲狀的形態(tài)具有一定的診斷意義。

銅綠假單胞菌也稱綠膿桿菌，廣泛分布于自然界、土壤、水、空氣，且可以長期存在于人體的體表及腔道中，是臨床常見的條件致病菌，能引起人及多種動(dòng)物（牛、羊、兔、禽類等）［6－8］發(fā)病。施氏假單胞菌也是假單胞菌中的一種，它可以利用其他假單胞菌不能利用的某些碳水化合物，且不能產(chǎn)生熒光色素［9］，該菌可引起人的菌血癥、骨骼感染（骨折感染、關(guān)節(jié)炎、脊髓炎等）、心內(nèi)膜炎、眼部感染、腦膜炎、肺炎、尿道感染等［9］。淺綠氣球菌和麥?zhǔn)习魲U菌也都是條件致病菌，廣泛分布于自然界。淺綠氣球菌在特定條件下可引起腦膜炎、菌血癥、尿道感染等［10］；麥?zhǔn)习魲U菌在特定條件下也可引起菌血癥、泌尿道感染等。這些細(xì)菌在人類可條件性地引起感染，但在動(dòng)物中的致病性還未知。

總之，我們從病死鴨中成功鑒定出7種細(xì)菌，其中沙門菌、大腸桿菌、鴨疫里默氏菌為常見的致病菌，而銅綠假單胞桿菌、施氏假單胞菌、淺綠氣球菌和麥?zhǔn)习魲U菌較為少見。雖然部分分離菌對鴨的致病能力還需進(jìn)一步的研究，但在鴨病控制過程中應(yīng)注意可能存在一些不常見細(xì)菌的混合感染。

［1］ 姚火春.獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)［M］.2版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001：36－42.

［2］ Said Ennahar，Yimin Cai，Yasuhito Fujita.Phylogenetic Diversity of Lactic Acid Bacteria Associated with Paddy Rice Silage as Determined by 16SRibosomal DNA Analysis［J］.Applied And Environmental Microbiology，2003，69（1）：444－450.

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［10］劉南，曹俊杰.尿道氣球菌與尿路感染［J］.國外醫(yī)學(xué)：臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊，2001，22（4）：233.