賈海英， 張 濤， 山艷春， 莫天石， 王繼群

(暨南大學(xué) 1 附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科， 2 醫(yī)學(xué)院耳鼻咽喉科，廣東 廣州 510632；3 澳門仁伯爵醫(yī)院耳鼻咽喉科)

LN和LN-R在鼻腔鼻竇惡性腫瘤中表達(dá)的臨床意義*

賈海英1△， 張 濤1， 山艷春2， 莫天石3， 王繼群2

(暨南大學(xué)1附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，2醫(yī)學(xué)院耳鼻咽喉科，廣東 廣州 510632；3澳門仁伯爵醫(yī)院耳鼻咽喉科)

目的探討層黏連蛋白(LN)及其受體(LN-R)在鼻腔鼻竇惡性腫瘤中表達(dá)的臨床意義。方法用免疫組化法檢測137例鼻腔鼻竇惡性腫瘤、78例癌旁組織和37例對(duì)照組織中LN和LN-R的表達(dá)。結(jié)果LN在鼻腔鼻竇惡性腫瘤中陽性表達(dá)率(13.87%)明顯低于癌旁組(87.18%)和對(duì)照組(72.97%)(P<0.01)，LN-R在鼻內(nèi)翻性乳頭狀瘤中的陽性表達(dá)率(76.47%)明顯高于鼻腔鼻竇惡性腫瘤(28.47%)、癌旁組織(10.26%)和鼻息肉或囊腫組織(10.0%)。LN-R在鼻腔鼻竇惡性上皮腫瘤和惡性軟組織腫瘤中的表達(dá)存在顯著差異(P<0.01)，而LN的表達(dá)無顯著差異(P>0.05)。結(jié)論LN的減少為惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移提供了條件，在鼻腔鼻竇惡性腫瘤中LN的檢測將為臨床治療提供可靠依據(jù)。LN-R具有組織特異性，需根據(jù)不同病理類型進(jìn)行深入研究。LN-R在鼻內(nèi)翻性乳頭狀瘤中高表達(dá)，其機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

層黏連蛋白； 受體，層黏連蛋白； 鼻咽腫瘤

鼻腔鼻竇惡性腫瘤具有復(fù)雜性和多樣性的特點(diǎn)，現(xiàn)有手段很難從根本上減少其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[1]。但如果能從分子水平上篩選出與鼻腔鼻竇惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的高危復(fù)發(fā)和死亡風(fēng)險(xiǎn)的生物學(xué)指標(biāo)，臨床上就可以借此治療及評(píng)估預(yù)后。層黏連蛋白(laminin,LN)和層黏連蛋白受體(laminin receptor,LN-R)是目前研究較為廣泛與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的因素，但關(guān)于LN和LN-R與鼻腔鼻竇惡性腫瘤的相關(guān)性尚未得到證實(shí)，本研究將初步探討鼻腔鼻竇惡性腫瘤與LN、LN-R的相關(guān)性，借此探討鼻腔鼻竇惡性腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移，用以指導(dǎo)鼻腔鼻竇惡性腫瘤臨床治療和評(píng)估預(yù)后。

材 料 和 方 法

1材料及試劑

病例資料選取廣州暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院和中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院經(jīng)病理證實(shí)的石蠟標(biāo)本，包括明確診斷的鼻腔鼻竇惡性腫瘤137例、癌旁組織78例和對(duì)照組37例。癌旁組織為鼻腔鼻竇惡性腫瘤術(shù)中切除安全緣，經(jīng)病理證實(shí)未見腫瘤。其中病例組及對(duì)照組基本情況見表1。鼻腔鼻竇惡性腫瘤的組織來源復(fù)雜，有10余種之多，按照世界衛(wèi)生組織(WHO)的腫瘤國際組織學(xué)分類可以將其分為3大類，即惡性上皮腫瘤、惡性軟組織腫瘤和惡性骨腫瘤。收集病例包括惡性上皮腫瘤78例，惡性軟組織腫瘤55例及4例惡性骨腫瘤。

表1 患者一般情況

LN即用型抗體、SP及PV9000試劑盒均購于北京中山金橋生物有限公司。LN-R濃縮型抗體，購于深圳晶美生物技術(shù)有限公司。

2方法

2.1免疫組織化學(xué)染色 組織石蠟厚4 μm切片，經(jīng)脫蠟至水化，微波爐加熱進(jìn)行抗原修復(fù)，正常血清封閉清除非特異性染色后，LN抗體按SP試劑盒、LN-R抗體按PV9000試劑盒說明分別進(jìn)行染色，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。以PBS替代Ⅰ抗作為陰性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)中LN-R稀釋濃度為1∶35。

2.2結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) LN陽性表達(dá)位于基底膜，陽性染色為棕黃色線性或碎片狀表達(dá)，根據(jù)瘤團(tuán)周圍基底膜線性染色的完整性分為[2]：線形結(jié)構(gòu)<5%，基本沒有形成基底膜，為“-”；線形結(jié)構(gòu)5%-25%，基底膜呈細(xì)小條索狀，為“+”；線狀結(jié)構(gòu)25%-75%，基底膜呈間斷性線狀，為“++”；線狀結(jié)構(gòu) >75%，幾乎有完整基底膜，為“+++”。

LN-R陽性部位為細(xì)胞膜，部分胞漿也出現(xiàn)棕黃色顆粒，染色分級(jí)：無表達(dá)或腫瘤細(xì)胞陽性數(shù)小于5%為陰性(-)；陽性細(xì)胞數(shù)大于5%且小于或等于25%為弱陽性(+)；陽性細(xì)胞數(shù)大于25%且小于或等于75%為中等強(qiáng)度陽性(++)；陽性細(xì)胞數(shù)大于75%為強(qiáng)陽性(+++)。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用統(tǒng)計(jì)軟件包SPSS 12.0 for Windows 進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。

結(jié) 果

LN的陽性表達(dá)位于基底膜，其在鼻腔鼻竇惡性腫瘤中的表達(dá)連續(xù)性間斷或呈碎片狀表達(dá)，而在正常黏膜和息肉的上皮基底部可見完整表達(dá)，見圖1。LN在鼻腔鼻竇惡性腫瘤、癌旁及對(duì)照組織中的表達(dá)見表2，LN在鼻息肉或囊腫、內(nèi)翻性乳頭狀瘤中的表達(dá)無顯著差異(P>0.05)，因此可將其合并為對(duì)照組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，LN在鼻腔鼻竇惡性腫瘤中陽性(+～+++)表達(dá)率(13.87%)明顯低于癌旁組(87.18%)和對(duì)照組(72.97%)，其表達(dá)具有顯著差異(P<0.01)。

Figure 1. The expression of LN in NPMT(A), para-cancer(B) and non-cancer tissues(C)(immunohistochemical staining, SP).A:+,×400; B:+++,×100；C:+++,×100.

表2 LN在鼻腔鼻竇惡性腫瘤、癌旁及對(duì)照組中的表達(dá)

LN-R的陽性部位為細(xì)胞膜，其表達(dá)見圖2。LN-R的表達(dá)見表3，LN-R在鼻息肉或囊腫及內(nèi)翻性乳頭狀瘤中的表達(dá)存在顯著差異(P<0.01)，不能將2組標(biāo)本合并同類項(xiàng)，因此需將對(duì)照組分成鼻息肉或囊腫組和內(nèi)翻性乳頭狀瘤組進(jìn)行分析。LN-R在內(nèi)翻性乳頭狀瘤中的陽性(+～+++)表達(dá)率(76.47%)明顯高于鼻腔鼻竇惡性腫瘤(28.47%)、癌旁組織10.26%和鼻息肉或囊腫組織(10.00%)，鼻腔鼻竇惡性腫瘤組中的陽性表達(dá)率也高于癌旁組和鼻息肉或囊腫組。LN-R在鼻腔及鼻竇惡性腫瘤組、癌旁組、息肉或囊腫和內(nèi)翻性乳頭狀瘤中的表達(dá)存在明顯差異(P<0.01)。

表3 LN-R在鼻腔鼻竇惡性腫瘤、癌旁及對(duì)照組中的表達(dá)

LN、LN-R在鼻腔鼻竇惡性上皮腫瘤和軟組織腫瘤中的表達(dá)見表4,可知LN在鼻腔鼻竇惡性腫瘤中的表達(dá)無顯著差異(P>0.05)，而LN-R的表達(dá)有顯著差異(P<0.01)，LN在惡性上皮腫瘤的陽性表達(dá)率(62.50%)明顯高于惡性軟組織腫瘤(19.60%)。

Figure 2. The expression of LN-R in NPMT(A), para-cancer(B) and invert papilloma(C)(immunohistochemical staining, PV9000).A:+++,×200; B:+++,×200；C:+++,×200.

表4 LN與LN-R在不同病理類型鼻腔鼻竇惡性腫瘤中的表達(dá)

討 論

LN是由Timple等從鼠EHS肉瘤中分離出的基質(zhì)，具有細(xì)胞黏附、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化、促進(jìn)細(xì)胞遷移、連接基膜中的大分子成分等功能，是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的重要組成成分之一，在基底膜的形成和穩(wěn)定中起重要作用。Pellegrini等[3]發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)侵潤型乳腺癌LN表達(dá)缺失，而在正常組織和良性病變中高表達(dá)。LN-R是許多不同細(xì)胞表面分子的總稱，目前研究認(rèn)為LN-R是一種與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的跨膜受體，能與基底膜中的主要成分LN結(jié)合，促進(jìn)多種蛋白水解酶的分泌，促進(jìn)基底膜的降解[4]。LN-R根據(jù)與LN作用方式的不同可將LN-R分為整合素和非整合素2大家族[5]。Liotta等[6]發(fā)現(xiàn)侵潤性乳腺癌分離出的LN-R明顯高于良性硬化性乳腺病患者，從而推論高轉(zhuǎn)移能力的細(xì)胞表面的LN-R比較多。

本研究發(fā)現(xiàn)LN在鼻惡性腫瘤的基底膜中結(jié)構(gòu)稀疏，或者變薄、斷裂，甚至僅有少量殘留，在鼻惡性腫瘤的陽性率表達(dá)明顯低于癌旁組和對(duì)照組。這可能是由于生長活躍的鼻腔鼻竇惡性腫瘤細(xì)胞合成、分泌LN的能力較一般良性腫瘤細(xì)胞下降，或與其分泌蛋白水解酶的水平高有關(guān)，從而使生長活躍的基底細(xì)胞穿透基底膜進(jìn)入基質(zhì)而發(fā)生癌變，認(rèn)為LN低表達(dá)的鼻腔鼻竇惡性腫瘤具有更強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移性，具有高復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，因此在臨床治療中需要采取更激進(jìn)的治療措施，例如擴(kuò)大手術(shù)范圍，手術(shù)前后增加放療劑量或增加化療等治療手段，并且建議縮短隨訪周期、增加隨訪次數(shù)，盡早發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)LN-R在鼻息肉和囊腫及內(nèi)翻性乳頭狀瘤中的表達(dá)存在差異，因此，不能將2組標(biāo)本合并同類項(xiàng)為對(duì)照組，需對(duì)此進(jìn)行分組討論。LN-R在鼻內(nèi)翻性乳頭狀瘤中的陽性表達(dá)率明顯高于鼻腔鼻竇惡性腫瘤、癌旁組和鼻息肉或囊腫組，認(rèn)為LN-R可能在鼻內(nèi)翻性乳頭狀瘤中發(fā)揮重要作用，其機(jī)制仍待進(jìn)一步深入研究。LN在不同病理類型的鼻腔鼻竇惡性中的表達(dá)無顯著差異，而LN-R的表達(dá)有顯著差異，LN-R具組織特異性，這可能因?yàn)長N-R分類較多，可能不同家族成員與病理類型惡性腫瘤有一定相關(guān)性，因此以后關(guān)于LN-R的研究需根據(jù)不同病理類型進(jìn)行，關(guān)于LN-R在不同病理類型的鼻腔鼻竇惡性腫瘤如何發(fā)揮作用仍待進(jìn)一步研究。

目前，關(guān)于鼻腔鼻竇惡性腫瘤的分子學(xué)研究還剛剛起步，關(guān)于LN和LN-R與鼻腔鼻竇惡性腫瘤的相關(guān)性研究，尤其是對(duì)不同病理類型及LN-R不同家族成員的深入研究將有助于明確其生物學(xué)機(jī)制，了解鼻腔鼻竇惡性腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移及鼻內(nèi)翻性乳頭狀瘤的機(jī)制，篩選與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的指標(biāo)，將為鼻腔鼻竇惡性腫瘤制定治療方案和評(píng)估預(yù)后以及預(yù)防鼻內(nèi)翻性乳頭狀瘤提供重要依據(jù)。

[1] 練 兵，王繼群，金 琳.靶向PCNA基因的小干擾RNA對(duì)鼻咽癌CNE2細(xì)胞周期的影響[J].中國病理生理雜志，2009，25(8)：1533-1537。

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ClinicalsignificanceofLN/LN-Rexpressioninnasalandparanasalsinusmalignanttumor

JIA Hai-ying1, ZHANG Tao1, SHAN Yan-chun2, MO Tian-shi3, WANG Ji-qun2

(1DepartmentofOtolaryngology-HeadandNeckSurgery,TheFirstAffiliatedHospital,2DepartmentofOtolaryngology,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China;3CentroHospitalarCondeDeS.Januario,Macau,China.E-mail:jiahaiying79@126.com)

AIM: To study the clinical significance of laminin/laminin receptor(LN/LN-R) expression in nasal and paranasal sinus malignant tumor(NPMT).METHODSThe immunohistochemical technique was used to detect the expression of LN and LN-R in 137 cases of NPMT, 78 cases of para-cancer tissues and 37 cases of non-cancer tissues.RESULTSThe positive rate of LN in NPMT(13.87%) was significantly lower than that in para-cancer tissues(87.18%) and non-cancer tissues(72.97%), and the positive rate of LN-R in nasal inverting papilloma(76.47%) was significantly higher than that in NPMT(28.47%), para-cancer tissues(10.26%) and nasal polypus and cyst tissues(10.0%). A significant difference of LN-R expression, but not LN, between endepidermis and soft tissue of the NPMT was observed(P<0.01).CONCLUSIONDecrease in LN expression provides the essential condition for the invasion and metastasis of the malignant tumor. Determining the expression level of LN in NMPT will be helpful for evaluation of tumor development and clinical management. High expression of LN-R only in the nasal inverting papilloma indicates that LN-R may play different roles in different pathotypes of NPMT.

Laminin; Receptors, laminin; Nasopharyngeal neoplasms

R739.6

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.02-014

1000-4718(2011)02-0284-04

2010-05-21

2010-07-09

廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 9451063201003299)；澳門科研基金委員會(huì)資助項(xiàng)目(No.029/2009/A)

△通訊作者 Tel:020-38688123；E-mail: jiahaiying79@126.com