馬建霞 司佩任 吳洪玉 王洛偉 潘雪 高軍 李兆申 金震東

·論著·

原位注射法建立人胰腺癌SW1990裸鼠種植瘤模型及高頻內(nèi)鏡超聲探頭對(duì)其的監(jiān)測(cè)

馬建霞 司佩任 吳洪玉 王洛偉 潘雪 高軍 李兆申 金震東

目的建立裸小鼠人胰腺癌原位種植瘤模型，探索監(jiān)測(cè)種植瘤生長(zhǎng)的方法。方法將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胰腺癌細(xì)胞株SW1990制備成細(xì)胞懸液，原位注射于Balb/c-nu裸小鼠胰腺尾部包膜下,利用高頻內(nèi)鏡超聲(EUS)探頭體表觀察腫瘤結(jié)節(jié)的生長(zhǎng)及聲像圖像。結(jié)果20只裸小鼠均接種成功，1只裸鼠于接種后25 d時(shí)死亡。接種后14 d，EUS檢查的瘤體大小為(8.09±2.61)mm3，腫瘤結(jié)節(jié)呈均質(zhì)低回聲,邊界清楚,周邊有包膜及聲暈,形態(tài)規(guī)則，30%的腫瘤結(jié)節(jié)周邊可見(jiàn)低速環(huán)繞彩色血流信號(hào)；接種后28 d，瘤體增大至(12.40±3.51)mm3,70%的腫瘤結(jié)節(jié)呈不規(guī)則形,部分為分葉狀,腫塊呈低回聲,不均質(zhì),未見(jiàn)液化壞死區(qū)，70%的腫瘤結(jié)節(jié)周邊可見(jiàn)低速環(huán)繞彩色血流信號(hào)。結(jié)論原位注射法是建立裸小鼠人胰腺癌原位種植瘤模型較理想的方法，操作簡(jiǎn)便，成瘤率高；高頻內(nèi)鏡超聲顯像是可靠的監(jiān)測(cè)胰腺原位種植瘤的手段。

胰腺腫瘤； 模型，動(dòng)物； 內(nèi)鏡超聲檢查

裸鼠胰腺原位癌模型與人的胰腺癌自然病程一致，而且其腫瘤微環(huán)境與人胰腺癌相似，成為胰腺癌實(shí)驗(yàn)研究中最常用的動(dòng)物模型之一。如何更加方便、高效地建立模型，并實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)裸小鼠胰腺腫瘤的生長(zhǎng)成為裸鼠模型成功的研究重點(diǎn)。以往常通過(guò)手術(shù)方式在胰腺原位種植裸鼠皮下移植瘤組織塊的方法。但該法對(duì)外科技術(shù)要求高，腫瘤組織塊可能脫落入腹腔造成腹腔種植。為此，本實(shí)驗(yàn)采用原位注射人胰腺癌細(xì)胞懸液的方法建立裸鼠胰腺癌原位模型,并采用高頻內(nèi)鏡超聲探頭監(jiān)測(cè)其生長(zhǎng)規(guī)律及聲像圖特征。

資料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑及儀器

人胰腺癌細(xì)胞株SW1990購(gòu)自美國(guó)ATCC公司，常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 ng/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液,每2 d換液，3～4 d傳代。20只4～6周齡雄性Balb/c-nu裸鼠，體重18～20 g，購(gòu)自中科院動(dòng)物中心，獲國(guó)家動(dòng)物品系合格證，于第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心SPF(specific-pathogen free)級(jí)分籠飼養(yǎng)。DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、L-谷氨酰胺、二甲基亞砜(DMSO)、胰蛋白酶為北京天來(lái)公司產(chǎn)品，胎牛血清為PAA Laboratories GmbH產(chǎn)品。超聲探頭為Olympus環(huán)形掃描超聲內(nèi)鏡GF-UE260-α5的75Hz的高頻探頭。

二、模型制備及監(jiān)測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SW1990細(xì)胞，稀釋成1×107/ml細(xì)胞懸液。裸鼠麻醉后取右側(cè)位，常規(guī)消毒鋪巾后剖腹，暴露胰腺尾部，于胰腺尾部包膜下接種0.2 ml細(xì)胞懸液(圖1a)。術(shù)后自由飲水、進(jìn)食。每日記錄裸鼠的一般情況，觀察有無(wú)手術(shù)并發(fā)癥，稱(chēng)體重。接種14 d及28 d對(duì)裸鼠進(jìn)行超聲觀測(cè)(圖1b)。觀察前將超聲儀和檢查探頭用1%醋酸洗必泰液搽洗1次,檢查室用紫外線燈照射2 h,檢查時(shí)穿無(wú)菌隔離衣。將裸鼠麻醉后置于無(wú)菌水中，內(nèi)鏡超聲探頭水囊充滿，貼近裸鼠腹壁，觀察腫瘤二維聲像圖及彩色血流信號(hào)，測(cè)量腫瘤長(zhǎng)、寬、厚三個(gè)徑線,每個(gè)徑線均測(cè)3次,取平均值,腫瘤體積V=π/6×長(zhǎng)×寬×厚。

三、病理學(xué)檢查

接種后28 d,處死裸鼠,取腫瘤組織及肝臟、肺臟、腹膜等組織，常規(guī)行病理學(xué)檢查。

結(jié) 果

一、裸鼠一般狀況

20只裸鼠接種后7 d飲水、進(jìn)食正常，以后逐漸開(kāi)始出現(xiàn)納差，活動(dòng)力減弱，28 d后均出現(xiàn)消瘦、惡液質(zhì)等表現(xiàn)。接種后25 d有1只裸鼠死亡，解剖后發(fā)現(xiàn)死于胰腺癌腹腔種植，并發(fā)腸梗阻。荷瘤鼠在7、14、21、28 d的平均體重分別為19.2、20.5、18.7、17.0 g。

二、超聲觀察結(jié)果

20只裸小鼠均接種成功。接種后14 d，超聲檢查裸鼠胰腺原位均形成瘤結(jié)節(jié)，大小為(8.09±2.61)mm3，呈均質(zhì)低回聲,邊界清楚,周邊有包膜及聲暈,形態(tài)規(guī)則，30%的腫瘤結(jié)節(jié)周邊可見(jiàn)低速環(huán)繞彩色血流信號(hào)。接種后28 d，瘤體增大至(12.40±3.51)mm3,70%的腫瘤結(jié)節(jié)呈不規(guī)則形,部分為分葉狀,腫塊呈低回聲,不均質(zhì),未見(jiàn)液化壞死區(qū)，70%的腫瘤結(jié)節(jié)周邊可見(jiàn)低速環(huán)繞彩色血流信號(hào)(圖2)。

圖1胰腺原位注射SW1990細(xì)胞(a)及裸小鼠胰腺種植瘤的內(nèi)鏡超聲探頭檢查(b)

圖2 接種后14 d(a)和28 d(b)裸鼠種植瘤的超聲圖像

三、種植瘤的病理改變

處死時(shí)有3只裸鼠可見(jiàn)血性腹水。胰腺原位腫瘤呈多個(gè)灰白色或灰黃色結(jié)節(jié)、質(zhì)硬，類(lèi)圓形、分葉狀或結(jié)節(jié)狀(圖3a)。光鏡下見(jiàn)腫瘤細(xì)胞排列紊亂、分化差、核深染,每高倍視野可見(jiàn)核分裂象8～10個(gè),組織內(nèi)偶見(jiàn)導(dǎo)管及腺泡,可見(jiàn)較多血管腔,并可見(jiàn)微血管，周?chē)认俳M織正常(圖3b)。肺臟均未見(jiàn)轉(zhuǎn)移灶。一只裸鼠肝臟出現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶。

圖3裸鼠種植胰腺癌的大體標(biāo)本(a)及病理改變(b，HE ×200)

討 論

動(dòng)物模型是腫瘤實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)，由于裸鼠缺乏胸腺，不具備T細(xì)胞免疫力，故對(duì)異種移植不產(chǎn)生排斥反應(yīng)，成活率高[1]，因此，裸鼠是最多用來(lái)建立腫瘤模型的動(dòng)物。裸鼠胰腺癌移植瘤動(dòng)物模型制備方法主要有三種：人胰腺癌細(xì)胞裸鼠皮下種植模型、脾內(nèi)注射肝轉(zhuǎn)移模型和外科胰腺原位種植模型。

皮下種植腫瘤成功率高,具有易于治療和觀察療效的優(yōu)點(diǎn)，但皮下瘤與人的胰腺癌自然病程不一致，且轉(zhuǎn)移灶的腫瘤生物學(xué)特性可以與原發(fā)灶不同[2]。原位種植法是采用直接來(lái)自新鮮外科標(biāo)本或裸鼠皮下移植瘤組織，通過(guò)原位種植于裸鼠胰腺內(nèi)建立胰腺腫瘤模型。由于原位種植，腫瘤可維持癌細(xì)胞來(lái)源的組織結(jié)構(gòu)和其生物學(xué)特性，在宿主體內(nèi)以更類(lèi)似于人類(lèi)的方式顯示其惡性行為。但在胰腺包膜下接種組織塊難度較大，容易造成出血、胰瘺

以及組織塊脫落等并發(fā)癥，且手術(shù)費(fèi)時(shí)，裸鼠死亡率較高。

1995年Alisaukus等[3]采用原位注射皮下瘤塊組織液的方法建立胰腺癌模型，但依然費(fèi)時(shí)。本文采用于胰腺原位直接注射培養(yǎng)的胰腺癌細(xì)胞懸液，成瘤率達(dá)100%，并發(fā)癥低，死亡率5%，效果理想。

為監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)情況，通常使用高場(chǎng)強(qiáng)磁共振及臨床性線圈急性掃描[4]，耗時(shí)長(zhǎng)，成本高。我們?cè)捎贸曁筋^對(duì)裸鼠胰腺種植瘤進(jìn)行監(jiān)測(cè)，但因普通探頭過(guò)大，頻率低，無(wú)法對(duì)裸鼠這種超小型動(dòng)物腹腔內(nèi)腫瘤進(jìn)行很好地觀察，所以我們改用了內(nèi)鏡超聲的高頻超聲探頭，結(jié)果能清晰地顯示荷瘤裸小鼠的胰腺癌結(jié)節(jié)聲像圖，且能獲得血流信號(hào)，為種植瘤提供更多的信息，是一種較理想的監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)的手段。

[1] 孟令新，李強(qiáng)，郭仁德，等．裸鼠胰腺癌動(dòng)物模型及其應(yīng)用進(jìn)展．中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2006，23：1583-1584．

[2] Schuetz JD,Schuetz EG.Extracellular matrix regulation of multidrug resistance in primary monolayer culture of adult rat hepatocytes．Cell Growth Differ,1993,4：31-40．

[3] Alisauskus R,Wong GY,Gold DV.Initial studies of monoclonal antibody PAM4 targeting to xenografted orthotopic pancreatic cancer.Cancer Res,1995,55：5743s-5748s．

[4] 何偉，王冬青，孫維斌，等.人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1裸鼠原位模型的建立及磁共振監(jiān)測(cè).中華胰腺病雜志,2009,9:328-330.

2011-01-13)

(本文編輯：呂芳萍)

Establishoftheorthotopichumanpancreaticcancermodelinmiceandhighfrequencyprobeofendoscopyultrasonographicmonitoring

MAJian-xia,SIPei-ren,WUHong-yu,WANGLuo-wei,PANXue,GAOJun,LIZhao-shen,JINZhen-dong.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

JINZhen-dong,Email:zhendjin@126.com

ObjectiveTo establish the orthotopic human pancreatic cancer model in mice and study the method to detect the tumor growth.MethodsHuman pancreatic cancer cell lines SW1990 in logarithmic phase was made into cell suspension and in situ injected into the envelope of pancreatic tail of BALB/c nude mice. High-frequency endoscopy ultrasound was used to observe the growth of tumor mass and its imaging characteristics were studied.Results20 nude mice were successfully implanted, and 1 died 25 h after implantation. 14 days after implantation, the tumor of pancreatic cancer on EUS was(8.09±2.61)mm3, the tumor appeared as homogeneous hypoechoic mass with clear boundary, and envelope as well as sound halo was present, and the shape was regular; there was low speed circular vasculature signal in around 30% of tumor. The tumor size increased to (12.40±3.51)mm3, and the shape of 70% tumor was irregular, and some appeared as lobulated, and the tumor appeared as heterogeneous hypoechoic mass, no necrosis or liquefaction was found 28 days after implantation. There was low speed circular vasculature signal in around 70% tumors.ConclusionsThe orthotopic pancreatic cancer model in nude mouse can be established by in situ injection and this method is relatively ideal because it is simple and effective. The high frequency probe of endoscopic ultrasonograph is a reliable method for monitoring implanted pancreatic cancer.

Pancreatic neoplasms; Model, animal; Endoscopy Ultrasonography

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.01.013

國(guó)家自然科學(xué)基金(C171006)

200433 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院消化內(nèi)科

金震東，Email:zhendjin@126.com