顧俊駿 高軍 龔燕芳 黃浩杰 王小瑋 路華 李兆申

·論著·

胰腺癌組織K-ras基因第12密碼子突變的定量檢測(cè)

顧俊駿 高軍 龔燕芳 黃浩杰 王小瑋 路華 李兆申

目的檢測(cè)胰腺癌及相應(yīng)癌旁組織K-ras基因第12密碼子的突變量，分析其與胰腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系。方法應(yīng)用肽核酸(peptide nucleic acid，PNA)鉗制雙熒光標(biāo)記探針的實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)93例胰腺癌組織及其癌旁組織中K-ras基因第12密碼子的突變拷貝數(shù)，以突變百分率表示突變量。K-ras基因突變百分率=K-ras突變型拷貝數(shù)/(K-ras野生型拷貝數(shù)+K-ras突變型拷貝數(shù))×100%。結(jié)果胰腺癌及其癌旁組織的K-ras基因第12密碼子突變率分別為83.9%和65.6%，相差顯著(P<0.05)；它們的突變量分別為(13.385±1.745)%和(2.246±0.728)%，相差亦顯著(P<0.05)。K-ras基因第12密碼子突變量與臨床病理參數(shù)無(wú)關(guān)。結(jié)論胰腺癌及相應(yīng)癌旁組織不僅存在K-ras基因突變率的差異，亦存在K-ras基因突變量的差異。

胰腺腫瘤； K-ras基因； 實(shí)時(shí)定量PCR； 突變

K-ras基因突變率在胰腺導(dǎo)管增生中為26%，乳頭狀增生中為46%，原位癌中為76%，導(dǎo)管癌中為82%[1]，且98%的突變發(fā)生在第12密碼子[2-3]。晚近文獻(xiàn)[4]報(bào)道，K-ras突變量也存在差異，定量檢測(cè)K-ras基因突變可為胰腺癌的診斷提供更好的參考價(jià)值。為此，本實(shí)驗(yàn)室采用雙熒光標(biāo)記探針實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)胰腺癌及其癌旁組織的K-ras基因第12密碼子的突變量，分析其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，探討其臨床應(yīng)用價(jià)值。

材料和方法

一、臨床資料

收集2006年4月至2009年9月我院手術(shù)治療的經(jīng)病理證實(shí)的胰腺癌患者93例。其中男性54例，女性39例，年齡35～77歲，中位年齡59歲。所有患者術(shù)前均未進(jìn)行化療和放療。

二、方法

1．肽核酸(peptide nucleic acid，PNA)鉗制實(shí)時(shí)熒光定量PCR法：應(yīng)用酚-氯仿法抽提胰腺癌及相應(yīng)癌旁組織的DNA。針對(duì)野生型K-ras基因第12、13密碼子自行設(shè)計(jì)PNA，由韓國(guó)panagene公司合成。K-ras-FAM Tagman MGB野生型GGT序列，突變型GAT、GTT、GCT、AGT、TGT、CGT序列參閱發(fā)明專利(專利申請(qǐng)?zhí)枺?01010512125.4)。引物自行設(shè)計(jì)后均由美國(guó)Applied Biosystems公司合成。K-ras上游引物5′-AGGCCTGCTGAAAATGACTGAAT-3′，下游引物5′-TTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCT-3′。TaqMan Gene Expression Master Mix購(gòu)買于美國(guó)Applied Biosystems公司。K-ras基因野生型標(biāo)準(zhǔn)品GGT和K-ras基因突變型標(biāo)準(zhǔn)品GAT、GCT、GTT、AGT、CGT、TGT由上海Invitrogen公司合成。操作儀器選用ABI公司的7500型實(shí)時(shí)定量PCR儀。反應(yīng)體系包括：TaqMan Gene Expression Master Mix 12.5 μl，上、下游引物各 0.5 μl(5 pmol/μl)，PNA 1 μl(10 pmol/μl)，MGB探針各0.3 μl(10 pmol/μl)，DNA標(biāo)準(zhǔn)品模板為106、105、104、103、102、10、0拷貝，用無(wú)菌雙蒸水定容至25 μl。PCR反應(yīng)條件：95℃ 10 min，95℃ 15 s、76℃ 15 s，60℃ 60 s， 50個(gè)循環(huán)。

2．K-ras基因第12密碼子突變類型和定量分析： K-ras第12密碼子第一堿基 GAT、GTT、GCT三種突變類型由FAM熒光標(biāo)記； K-ras第12密碼子第二堿基AGT、TGT、CGT三種突變類型由VIC熒光標(biāo)記。根據(jù)熒光類型判定K-ras第12密碼子突變類型。采用標(biāo)準(zhǔn)品絕對(duì)定量PCR的方法得到每個(gè)樣本的K-ras野生型和K-ras突變型的拷貝數(shù)。由于試劑批次、儀器設(shè)備、實(shí)驗(yàn)操作等因素對(duì)檢測(cè)的突變拷貝數(shù)影響較大，而突變百分率能夠更準(zhǔn)確和穩(wěn)定地反映突變量[5]，故本文采用突變百分率表示。K-ras基因突變百分率=K-ras突變型拷貝數(shù)/(K-ras野生型拷貝數(shù)+K-ras突變型拷貝數(shù))×100%。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、K-ras基因第12密碼子的突變率

實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。78例胰腺癌K-ras基因第12密碼子發(fā)生突變，突變率為83.9%(78/93)，其中第一堿基突變64例，第二堿基突變14例。61例癌旁組織K-ras基因第12密碼子發(fā)生突變，突變率為65.6%(61/93)，其中第一堿基突變51例，第二堿基突變10例。胰腺癌與癌旁組織的K-ras基因第12密碼子突變率相差顯著(P<0.05)。

二、K-ras基因第12密碼子的突變百分率及其比值

胰腺癌及其癌旁組織的K-ras基因第12密碼子突變百分率分別為(13.385±1.745)%和(2.246±0.728)%，兩者差異顯著(P<0.05，圖2)。

圖1野生型K-ras基因和突變型K-ras基因的擴(kuò)增曲線(a、c)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(b、d)

圖2胰腺癌及其癌旁組織中K-ras基因第12密碼子的突變百分率

93例配對(duì)的胰腺癌及其癌旁組織中K-ras基因

第12密碼子突變百分率的比值為44.4±9.6。其中82例胰腺癌組織K-ras基因的突變百分率高于相應(yīng)的癌旁組織，它們的比值為57.8±12.0；11例癌組織的突變百分率低于相對(duì)的癌旁組織，其比值為-3.2±1.0。

三、K-ras基因第12密碼子突變百分率與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

K-ras基因的突變與年齡、性別、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和臨床分期等臨床病理參數(shù)均無(wú)關(guān)(表1)。

表1胰腺癌及其癌旁組織K-ras基因突變百分率與腫瘤臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

臨床參數(shù) 癌組織r值(P值)癌旁組織r值(P值)年齡 -0.048(0.662)0.137(0.210)性別 -0.024(0.828)0.063(0.559)腫瘤大小 0.022(0.843)0.130(0.242)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移-0.155(0.157)0.137(0.211)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移 -0.128(0.243)-0.130(0.236)臨床分期 -0.153(0.168)0.091(0.415)

討 論

K-ras基因突變通常被認(rèn)為是胰腺癌發(fā)生的早期事件，并且K-ras基因的突變率從正常胰腺導(dǎo)管細(xì)胞、慢性胰腺炎的扁平或者乳頭狀異型增生到胰腺癌逐步升高[5]。即使存在K-ras基因突變，其突變量的高低也不同。

定量檢測(cè)K-ras基因突變不僅可以測(cè)定突變拷貝量，同時(shí)能夠?qū)-ras基因突變類型進(jìn)行分析，而無(wú)需進(jìn)一步測(cè)序，具有省時(shí)、方便的特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)在106拷貝數(shù)的野生型K-ras基因中可檢出的突變型K-ras基因的最低拷貝數(shù)為10，突變型與野生型的比例達(dá)1∶105，即檢測(cè)靈敏度為0.001%，其特異性幾乎達(dá)100%，顯著高于目前常用的高分辨率溶點(diǎn)曲線分析1%～0.1%的靈敏度[6]。

Tada等[4]采用K-ras基因定量法檢測(cè)不同胰腺疾病的標(biāo)本,結(jié)果提示胰腺癌的K-ras基因突變量高于良性胰腺病變，而且良性胰腺病變即使存在K-ras基因突變, 其突變量也較低。Shi等[7]定量檢測(cè)胰腺癌和慢性胰腺炎患者胰液中的K-ras突變百分率，結(jié)果顯示胰腺癌患者胰液中K-ras的突變百分率為0.05%～82%，明顯高于慢性胰腺炎患者的0～0.7%,并且胰腺癌胰液的K-ras突變類型與原發(fā)腫瘤相一致。本結(jié)果也顯示，胰腺癌組織K-ras突變百分率顯著高于相應(yīng)癌旁組織。但本組有11例胰腺癌K-ras基因突變百分率低于癌旁組織，其原因可能是未運(yùn)用顯微切割造成取材的誤差，也可能是由于腫瘤的異質(zhì)性所致[6]。

本方法不僅可以檢測(cè)手術(shù)、穿刺活檢等K-ras基因突變百分率較高的組織標(biāo)本，更適合用于諸如血漿、血清、胰液、胸腹水等K-ras基因突變百分率較低的樣本。目前，我們正在對(duì)胰腺疾病患者血液中K-ras基因突變量進(jìn)行檢測(cè)，初步顯示K-ras基因突變量的檢測(cè)對(duì)腫瘤的診斷、療效的評(píng)價(jià)以及生存期的預(yù)測(cè)都可能有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。

[1] Cerny WL,Mangold KA,Scarpelli DG.K-ras mutation is an early event in pancreatic duct carcinogenesis in the Syrian golden hamster.Cancer Res,1992,52:4507-4513.

[2] Queneau PE,Adessi GL,Thibault P,et al.Early detection of pancreatic cancer in patients with chronic pancreatitis: diagnostic utility of a K-ras point mutation in the pancreatic juice.Am J Gastroenterol,2001,96:700-704.

[3] Forrester K,Almoguera C,Han K,et al.Detection of high incidence of K-ras oncogenes during human colon tumorigenesis.Nature,1987,327:298-303.

[4] Tada M,Komatsu Y,Kawabe T,et al.Quantitative analysis of K-ras gene mutation in pancreatic tissue obtained by endoscopic ultrasonography-guided fine needle aspiration:clinical utility for diagnosis of pancreatic tumor.Am J Gastroenterol,2002,97:2263-2270.

[5] Bai RK,Wong LJ.Detection and quantification of hepatoplasmic mutant mitochondrial DNA by real-time amplification refractory mutation system quantitative PCR analysis:a single-step approach.Clin Chem,2004,50:996-1001.

[6] Kramer D,Thunnissen FB,Gallegos-Ruiz MI,et al.A fast sensitive and accurate high resolution melting (HRM) technology-based assay to screen for common K-ras mutations.Cell Oncol,2009,31:161-167.

[7] Shi C,Fukushima N,Abe T,et al.Sensitive and quantitative detection of KRAS2 gene mutations in pancreatic duct juice differentiates patients with pancreatic cancer from chronic pancreatitis,potential for early detection.Cancer Biol Ther,2008,7:353-360.

2010-10-20)

(本文編輯：屠振興)

QuantitativedetectionofmutationofK-rasgeneatcodon12

GUJun-jun,GAOJun,GONGYan-fang,HUANGHao-jie,WANGXiao-wei,LUHua,LIZhao-shen.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryUniversity,Shanghai200433,China

LIZhao-shen,Email:zhsli@81890.net

ObjectiveTo quantitatively analyze the K-ras gene mutation at codon 12 in pancreatic cancer tissues and the relationship between K-ras gene mutation and clinicopathological parameters.MethodsQuantitative detection of K-ras gene at codon 12 in 93 pairs of pancreatic cancer and adjacent tissues were performed by using PNA-mediated PCR clamping with two different fluorescence labeled probes. The quantity of mutation was expressed by percentage of mutation. The percentage of K-ras gene mutation=the copy of K-ras mutation/(copy of wild type K-ras+copy of K-ras mutation)×100%.ResultsThe percentage of mutation of K-ras gene at codon 12 in pancreatic cancer and adjacent tissues were 83.9% and 65.6%, and the difference was statistically significant(P<0.05); and the quantity of mutation were (13.385±1.745)% and (2.246±0.728)%, and the difference was also statistically significant(P<0.05). The quantity of mutation of K-ras gene at codon 12 was not associated with clinicopathological parameters.ConclusionsThe percentage of K-ras gene mutation, as well as the quantity of K-ras gene mutation was different in pancreatic carcinoma and adjacent tissues.

Pancreatic neoplasms; K-ras gene; Rreal-time PCR; Mutation

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.01.011

國(guó)家科技支撐計(jì)劃資助(2006BAI2A12)

200433 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院消化內(nèi)科

李兆申，Email：zhsli@81890.net