張 術(shù)，陳雅琳，欒 潔，卞曉嵐，汪家春

(1.海軍醫(yī)學(xué)研究所，上海 200433；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院盧灣分院，上海 200020；3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院，上海 200025)

不同來源石斛對SH-SY5Y細(xì)胞缺血性損傷保護(hù)作用的比較

張 術(shù)1，陳雅琳1，欒 潔1，卞曉嵐2，3，汪家春1

(1.海軍醫(yī)學(xué)研究所，上海 200433；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院盧灣分院，上海 200020；3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院，上海 200025)

目的研究市售種植鐵皮楓斗和組培鐵皮石斛對谷氨酸損傷的SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用。方法利用血清藥理學(xué)方法制備含藥血清，用SH-SY5Y細(xì)胞建立谷氨酸損傷模型，觀察72 h損傷細(xì)胞增殖情況，MTT實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞活性，乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的測定研究兩種來源石斛對神經(jīng)細(xì)胞損傷保護(hù)作用。結(jié)果種植和組培石斛均可提高SH-SY5Y細(xì)胞谷氨酸損傷的存活率，降低培養(yǎng)液中LDH含量和細(xì)胞內(nèi)MDA含量，提高SOD活力，其中鐵皮石斛胚芽的抗氧化能力優(yōu)于市售鐵皮楓斗。結(jié)論石斛具有對SH-SY5Y細(xì)胞谷氨酸損傷的保護(hù)作用；組培鐵皮石斛較市售鐵皮楓斗保護(hù)作用更加顯著，初步證明經(jīng)過組培繁殖的鐵皮石斛作用效果優(yōu)于市售石斛屬藥用植物。

鐵皮石斛;血清藥理學(xué) SH-SY5Y細(xì)胞;谷氨酸;細(xì)胞損傷

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimuraetMigo)，又稱黑節(jié)草，具有“千金草”之稱?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》記載石斛“久服厚腸胃, 輕身,延年,長肌肉,逐皮膚邪熱,痹氣,定志除驚,……”，現(xiàn)代研究也表明，石斛具有抗衰老、抗氧化等功效[1]。具有藥用價值的石斛在我國有近四十種，野生資源已經(jīng)非常稀少，早在1987年就被國家列為野生藥材重點(diǎn)二級保護(hù)瀕危植物。課題組采集的野生安徽霍山石斛，取成年莖作為外植體，進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到具有很好的遺傳穩(wěn)定性的鐵皮石斛胚狀體(胚芽)。為評價組培石斛與市售石斛藥效，本研究利用血清藥理學(xué)的方法研究不同來源石斛在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y谷氨酸損傷方面的保護(hù)作用，探討其對神經(jīng)細(xì)胞缺血性損傷的保護(hù)作用，比較兩種來源石斛作用藥效。

1 材料和方法

1.1儀器 CO2培養(yǎng)箱(Forma Scientific Model3336)；倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS LX70)；激光共聚焦掃描顯微鏡，Leica TCS SP-2；酶標(biāo)儀,美國BIO Tek 公司。

1.2材料 SD大鼠24只，雌雄各半，體重180～220 g，由復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部提供。市售石斛(鐵皮楓斗)，產(chǎn)地云南，經(jīng)第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室黃寶康教授鑒定為蘭科植物金釵石斛(Dendrobiumnobile.Lindl.)；鐵皮石斛胚芽由上海湯振生物技術(shù)有限公司提供。

DMEM 培養(yǎng)基、新生小牛血清和胰酶均為美國Gibco公司，谷氨酸(Glutamate，Glu)、MTT為美國 Sigma 公司， SOD檢測試劑盒、LDH檢測試劑盒和MDA檢測試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品，其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1動物分組及含藥血清的制備 動物隨機(jī)分為3組，每組8只,雌雄各半。分為陰性對照組、市售鐵皮楓斗組、鐵皮石斛胚芽組。鐵皮楓斗用蒸餾水提取并濃縮至0.2 g/ml。根據(jù)成人用藥劑量和大鼠折算系數(shù)比公式折算[2]，各組灌胃劑量為6 g/kg，對照組給予等量生理鹽水。給藥3天，每天2次，于末次給藥后1 h ,將大鼠麻醉,腹主動脈取血分離血清, - 70 ℃冰箱保存。

1.3.2細(xì)胞模型制備 對數(shù)生長期SH-SY5Y細(xì)胞按1×105個/ml 接種于96孔培養(yǎng)板中。加入終濃度為 1、5、10、20、40、80、100 mM Glu的培養(yǎng)基與細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后計算細(xì)胞存活率，同時細(xì)胞吖啶橙(AO)染色比較正常細(xì)胞形態(tài)和模型細(xì)胞形態(tài)，確認(rèn)谷氨酸損傷細(xì)胞模型的最佳濃度。

1.3.3細(xì)胞增殖觀察 分別將兩種含藥血清加入到模型細(xì)胞培養(yǎng)基中，血清濃度10%，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，AO染色比較空白對照組、模型組和給藥組的細(xì)胞形態(tài)。

1.3.4MTT 法測定細(xì)胞活力 參照文獻(xiàn)[3]方法進(jìn)行，對數(shù)生長期細(xì)胞按1×105個/ml 接種于96 孔培養(yǎng)板中。細(xì)胞分成空白組、陰性血清對照組，市售鐵皮楓斗和鐵皮石斛胚芽組。酶標(biāo)儀測定吸光度A值。

1.3.5乳酸脫氫酶(LDH)活性的測定 按1.3.4方法，收集培養(yǎng)液進(jìn)行LDH活性的檢測。檢測方法依據(jù)試劑盒的說明進(jìn)行。酶標(biāo)儀測定OD值，波長490 nm。

1.3.6丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)的測定 細(xì)胞經(jīng)含藥血清處理后培養(yǎng)4 h，去除原培養(yǎng)液，D-Hank′s液洗2次，加入0.1 mol/L PBS-0.05 mmol/L EDTA (pH8.0)和1% Triton X-100溶解細(xì)胞，加入25% H3PO4沉淀蛋白，6 000 r/min離心30 min，取上清液，按試劑盒說明測定。

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞模型制備與細(xì)胞增殖觀察 終濃度分別為 1、5、10、20、40、80、100 mM Glu的培養(yǎng)基與細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后測定細(xì)胞存活率，細(xì)胞染色后可見：正常對照組細(xì)胞形態(tài)完整呈多邊形，突起完好，核為均勻淡藍(lán)色熒光，胞漿為淡紅色熒光，視野中可見少量自然凋亡細(xì)胞(圖1a)；隨著Glu濃度增大，細(xì)胞死亡脫落量增大，濃度為80 mM時，細(xì)胞減少約50%，同時可見很多凋亡或壞死細(xì)胞，胞漿呈強(qiáng)紅色熒光，形態(tài)不規(guī)則，胞核濃縮，呈強(qiáng)白色熒光(圖1b)。因此本實(shí)驗(yàn)采用80 mM Glu處理細(xì)胞模型。

加入含藥血清的模型細(xì)胞，孵育72 h，染色觀察細(xì)胞可見給藥組細(xì)胞形態(tài)接近完整，呈多邊形。視野可見少量凋亡細(xì)胞，核皺縮呈強(qiáng)熒光，胞體縮小(圖1c，d)。

abcd

圖1激光共聚焦顯微鏡觀察SH-SY5Y細(xì)胞給藥72h增殖情況(×200)

a-空白對照組；b-80 mM Glu模型組；c-市售鐵皮楓斗組；d-鐵皮石斛胚芽組

2.2MTT實(shí)驗(yàn) 以80 mM Glu作為SH-SY5Y細(xì)胞損傷模型， 應(yīng)用含不同來源石斛的血清作用于SH-SY5Y細(xì)胞24 h，發(fā)現(xiàn)含藥血清對Glu損傷細(xì)胞有顯著的保護(hù)作用(P<0.05，如表1)。

表1 不同濃度藥物血清對SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用

1)P<0.01,與80 mM Glu處理組比較

2.3LDH活性測定 Glu損傷的細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)LDH釋放明顯增加(P<0.01)。含藥血清加入培養(yǎng)液中可明顯降低損傷細(xì)胞LDH的釋放，與模型組相比，均有顯著性差異(P<0.01)，其中含鐵皮石斛胚芽血清組LDH水平低于含市售鐵皮楓斗血清組 (P<0.05)；空白血清組與模型組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表2。

表2 含石斛血清對Glu損傷的SH-SY5Y細(xì)胞LDH釋放的影響

1)P<0.01與正常對照組比較；2)P<0.01與模型組比較；3)P<0.05與鐵皮楓斗組比較

2.4MDA、SOD檢測結(jié)果 ROS在Glu導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷中起著重要作用，而SOD在細(xì)胞清除氧自由基的機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。筆者研究發(fā)現(xiàn)80 mM Glu處理細(xì)胞后培養(yǎng)基中SOD酶的含量與對照組比較顯著降低；含藥血清與模型組比較，SOD顯著升高(P<0.01)，含鐵皮石斛胚芽組SOD含量高于市售石斛組 (P<0.05)；空白血清組與模型組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。同時，含鐵皮楓斗和組培石斛血清能明顯減少M(fèi)DA的生成，與模型組比較差異顯著(P<0.01)，含鐵皮石斛胚芽組MDA含量低于鐵皮楓斗組 (P<0.05)。結(jié)果見表3。

表3 含石斛血清對Glu損傷的SH-SY5Y細(xì)胞MDA、SOD釋放的影響

1)P<0.01，與正常對照組比較；2)P<0.01，與模型組比較；3)P<0.05與鐵皮楓斗組比較

3 討論

現(xiàn)代藥理學(xué)認(rèn)為，石斛屬植物具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗腫瘤、抗衰老等功效。家兔實(shí)驗(yàn)表明，石斛能顯著提高超氧化歧化酶(SOD)水平,從而起到降低乳過氧物酶(LPO)的作用[5]。其中石斛的重要有效成分石斛多糖及酚類化合物均具有抗氧化作用。自由基水平的升高作用于機(jī)體引起組織和細(xì)胞的損傷，是許多疾病發(fā)生發(fā)展的重要因素。SOD能夠清除氧陰離子自由基，保護(hù)細(xì)胞，間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力[6,7]；MDA是氧自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸形成脂質(zhì)過氧化物的一種，其量的變化常常反映體內(nèi)脂質(zhì)過氧化物的程度，間接反映細(xì)胞損傷的程度[8,9]。自由基連鎖反應(yīng)是腦缺血損傷，尤其是遲發(fā)性神經(jīng)元損傷的主要原因[10]。筆者研究發(fā)現(xiàn)Glu引起的細(xì)胞過氧化反應(yīng)可以被含石斛血清顯著抑制，同時含石斛血清可以顯著提高細(xì)胞SOD酶的含量，從而加速ROS的清除。這一結(jié)果提示石斛具有對神經(jīng)細(xì)胞缺血性損傷的保護(hù)作用。

本研究選用的組織培養(yǎng)鐵皮石斛與市售鐵皮楓斗藥效學(xué)評價顯示，鐵皮石斛胚芽清除氧自由基、降低損傷神經(jīng)細(xì)胞LDH的釋放能力，以及對Glu損傷細(xì)胞的保護(hù)作強(qiáng)于市售石斛，表明組織培養(yǎng)鐵皮石斛優(yōu)于人工種植石斛來源的藥效，初步證明經(jīng)過組織培養(yǎng)快速繁殖可解決其資源緊缺問題的有效途徑。

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2011-03-16

[修回日期]2011-04-22

ProtectiveeffectofdifferentsourceofDendrobiiCaulisonischemicinjuryinSH-SY5Ycells

ZHANG Shu1，CHEN Ya-lin1，LUAN Jie1，BIAN Xiao-lan2,3, WANG Jia-chun1

(1. Naval Medical Research Institute of CPLA, Shanghai 200433, China；2. Luwan Branch of Ruijin Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200020,China; 3. Ruijin Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200025,China)

ObjectiveTo study the protective effects of plantingDendrobiicaulisand tissue culture plantingDendrobiumofficinaleKimuraetMigoon glutamate damage induced in cultured SH-SY5Y cells.MethodsThe sera were obtained from rats by using the serum pharmacology method, and cell damage model was established by treating SH-SY5Y cells with glutamate. the proliferation of damaged cells were observed by 72 h. MTT assay was used to test lactate dehydrogenase(LDH), malondialde-1yde(MDA)and superoxide dismutase (SOD) in the culture medium.ResultsBoth planting and tissue cultureDendrobiicauliscould promote the cell proliferation of glutamate damaged SH-SY5Y cells. They also could decrease LDH and MDA content and increase SOD level significantly. Tissue culturedDendrobiicaulispreceded planting ones in antioxidant potential.ConclusionDendrobiicaulishad protective effect on glutamate damaged SH-SY5Y cells. The protective effect of tissue culture one, while, was more distinctive than planting one, which could prove that officinal effect of tissue cultureDendrobiumhuoshanensewas preceded toDendrobiumplants.

DendrobiumofficinaleKimuraetMigo, serum pharmacology method, SH-SY5Y cells, glutamate, cell damage

張 術(shù)(1978-)，女，碩士，助理研究員.Tel:(021)81883189,E-mail:zh_shu@hotmail.com.

卞曉嵐.E-mail:bxl40338@rjh.com.cn.

R965

A

1006-0111(2011)06-0439-03