李 顏,朱金輝,李 丹,郭 澄

(上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院藥劑科，上海 200233)

·藥物分析·

RP-HPLC法測(cè)定中藥木賊中黃酮醇苷的含量

李 顏,朱金輝,李 丹,郭 澄

(上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院藥劑科，上海 200233)

目的建立以高效液相法測(cè)定中藥木賊中一個(gè)黃酮醇苷山奈酚-3-雙葡萄糖苷的含量方法。方法色譜柱為Calesil ODS-100(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-水(45:55)，流速為1.0 ml/min, 檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm, 柱溫30 ℃,進(jìn)樣量10 μl。結(jié)果山奈酚-3,7-雙葡萄糖苷的檢測(cè)濃度在0.003 12～0.104 mg/ml范圍內(nèi)與峰積分面積呈良好線性關(guān)系(r=0.999 9), 平均回收率為100.2%，RSD=1.74% (n=9)。3個(gè)不同產(chǎn)地批號(hào)的樣品中山奈酚-3-雙葡萄糖苷的含量均在0.30%以上。結(jié)論該方法簡(jiǎn)便、快捷、重復(fù)性好，可作為木賊藥材的質(zhì)量控制的方法。

木賊；黃酮醇苷；山奈酚-3-雙葡萄糖苷；反相高效液相法；含量測(cè)定

中藥木賊為木賊科木賊屬植物木賊Equisetum hiemale L. 的干燥地上部分。為《中國(guó)藥典》2010版收載品種，具有散風(fēng)熱、明目退翳的功效，可用于治療風(fēng)熱眼赤，迎風(fēng)流淚，目生云翳等病癥[1]?，F(xiàn)代植物化學(xué)研究表明木賊中主要含有黃酮和黃酮苷類成分，包括:山奈酚苷(山奈酚-3-雙葡萄糖苷(kaempferol-3-diglucoside)、山奈酚-3-雙葡萄糖-7-葡萄糖苷(kaempferol-3-diglucoside-7-glucoside)、山奈酚-3-葡萄糖-7-雙葡萄糖苷(kaempferol-3-glucoside-7-diglucoside)、草棉苷(herbacitrin)、芹菜素(apigenin)、木犀草素(luteolin)等[2～3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明木賊科植物的不同提取物或極性部位具有抗心肌缺血、降血壓、降血脂、鎮(zhèn)痛、保肝及抗腫瘤等多方面的生物活性[4]。2010版《中國(guó)藥典》中木賊的質(zhì)量控制方法為HPLC測(cè)定藥材75%甲醇提取液加鹽酸水解后的山奈素的含量。本實(shí)驗(yàn)前期的植物化學(xué)的研究中(植物化學(xué)研究將另發(fā)文報(bào)道)，發(fā)現(xiàn)木賊中主要含有的是以山奈酚為苷元的苷類化合物，所以本實(shí)驗(yàn)對(duì)其中一個(gè)主要的黃酮醇苷進(jìn)行了HPLC定量分析，更加直接的反映木賊的品質(zhì)，為進(jìn)一步提高木賊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1儀器 美國(guó)waters 高效液相色譜儀(600四元泵，在線脫氣機(jī)，2707自動(dòng)進(jìn)樣器，2998 PDA檢測(cè)器)；柱溫箱(Auto Science AT-330)；BP211D分析天平(德國(guó)賽多利斯公司)；JA2003型分析天平(上海良平儀器儀表有限公司)；KQ5200DB型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；TC-15套式恒溫器(海寧新華醫(yī)療器械廠)；色譜柱：Calesil ODS-100 250 mm×4.6 mm 5 μm (上海申越公司)；甲醇(色譜純，美國(guó)TEDIA公司)，超純水(美國(guó)Millipore simplicity 185純水系統(tǒng))，95%乙醇(藥用級(jí)，上海怡峰化工有效公司)，甲醇、無水乙醇(分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2試藥 山奈酚-3-雙葡萄糖苷對(duì)照品(自制，其化學(xué)結(jié)構(gòu)經(jīng)FAB-MS,1H-NMR,13C-NMR和DEPT譜確證，面積歸一化法檢測(cè)純度大于98%)；木賊藥材購(gòu)自上海虹橋中藥飲片廠,經(jīng)上海交通大學(xué)郭澄教授鑒定其原植物為木賊科木賊EquisetumhiemaleL.的干燥地上部分。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱 Calesil ODS-100 C18(250 mm×4.6 mm , 5 μm)；流動(dòng)相:甲醇-水 (45:55)；流速1.0 ml/min, 檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μl。

2.2對(duì)照溶液的制備 精密稱取對(duì)照品2.60 mg，置25 ml容量瓶中，加甲醇制成1.0 ml含0.104 mg對(duì)照品的溶液，搖勻，即得對(duì)照品儲(chǔ)備液，備用。

2.3供試品溶液的制備 精密稱取過3號(hào)篩的木賊干燥粉末0.1 g，加水10 ml，稱重，超聲處理45 min，取出，放置至室溫，再稱重，用水補(bǔ)足失重，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液0.3、0.5、1.0、5.0 ml，分別置于10 ml容量瓶中，甲醇定容，搖勻。按“2.1”色譜條件進(jìn)行分析。以進(jìn)樣濃度 (C) 為橫坐標(biāo)，峰面積積分值(A)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為A=1E+7C+6 235.5 (r=0.999 9，n=5)。結(jié)果表明，對(duì)照品檢測(cè)濃度在0.003 12～0.104 mg/ml范圍內(nèi)與峰積分面積呈良好線性關(guān)系。

2.5儀器精密度試驗(yàn) 取濃度0.010 4 mg/ml對(duì)照品溶液，按“2.1”色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次進(jìn)行分析。結(jié)果，對(duì)照品峰面積的RSD=0.86%，表明儀器精密度較好。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0、1、2、4、8、12 h按上述色譜條件進(jìn)行分析。結(jié)果，木賊中該黃酮醇苷的峰面積的RSD=2.94%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.7重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批樣品6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定。結(jié)果，木賊中該黃酮醇苷的含量的RSD=3.20%，表明方法重復(fù)性較好。

2.8加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品6份，分別精密加入3個(gè)不同濃度(樣品含量50%, 100%, 150%)的對(duì)照品溶液, 照按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

2.9樣品的含量測(cè)定 取不同來源的木賊樣品各0.1 g，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定峰面積并用外標(biāo)法計(jì)算樣品中該黃酮醇苷的含量。色譜圖見圖1，樣品含量測(cè)定結(jié)果見表2。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

圖1 高效液相色譜圖

產(chǎn)地批號(hào)平均含量(%)RSD(%)甘肅0804280．360．85黑龍江0909010．492．15遼寧0906050．392．06

3 討論

3.1木賊中主要含黃酮及其苷類化合物，其中以苷類為主，故對(duì)其提取溶媒和提取方法進(jìn)行了篩選優(yōu)化。選擇了不同濃度的乙醇(30%、50%、75%)、水和甲醇為提取溶媒進(jìn)行超聲提取，以黃酮醇苷的提取率為考察指標(biāo)，結(jié)果顯示，水為溶媒時(shí)的提取率最高。以水為提取溶媒考察超聲提取和加熱回流提取的提取率，結(jié)果顯示在相同時(shí)間內(nèi)超聲提取和加熱回流提取率無差異，因此選擇操作簡(jiǎn)便的超聲提取為提取方法。確定提取溶媒和提取方法后，分別考察了不同的超聲時(shí)間(30、45、60 min)對(duì)提取的影響，結(jié)果表明，超聲提取45 min即可達(dá)到最大提取率。

3.22010版《中國(guó)藥典》中控制木賊質(zhì)量含量方法中測(cè)定的，其操作步驟相對(duì)繁瑣，容易產(chǎn)生誤差，且未能直接反應(yīng)藥材的品質(zhì)。也有不同學(xué)者對(duì)木賊的質(zhì)量進(jìn)行了研究，用薄層掃描法測(cè)黃酮苷或水解后測(cè)槲皮素、山奈酚的含量[5～8]；本研究中建立的方法，簡(jiǎn)單、快捷并且能直接反映藥材的品質(zhì)，可作為木賊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的參考依據(jù)。

3.3木賊科其它種植物中同樣含有大量的黃酮醇苷類化合物。此類黃酮醇苷類化合物在抗氧化、抗炎、鎮(zhèn)痛等方面的活性也逐步被發(fā)現(xiàn)[9,10]，與木賊在臨床上用其清熱解毒的功效具有一定的相關(guān)性，因此選用黃酮醇苷作為木賊的質(zhì)量控制指標(biāo)成分更為合理。

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2010-07-13

[修回日期] 2009-08-31

DeterminationofaflavonolglycosideinEquisetumhiemalebyRP-HPLC

LI Yan, ZHU Jin-Hui, LI Dan，GUO Cheng

(Department of Pharmacy, Shanghai Sixth People′s Hospital, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200233, China)

ObjectiveTo establish a RP-HPLC method for determination of a flavonol glycoside in Equisetum hiemale.MethodsThe separation was performed on Calesil ODS-100(250 mm×4.6 mm,5 μm). Mobile phase consisted of methanol-water (45:55) with flow rate of 1.0 ml/min and detection wavelength of 254 nm. The column temperature was 30 ℃ and injection volume was 10 μl.ResultsThe linear range of the flavonol glycoside was 0.003 12～0.104 mg/ml with average recovery of 100.2% (RSD=1.74%,n=9 ). The method was applied to samples of Equisetum hiemale from different locations.ConclusionThe established method was proved to be simple, reproducible, accurate and could be used to evaluate the quality of Equisetum hiemale.

Equisetum hiemale; flavonal glycoside; kaempferol-3-diglucoside；RP-HPLC; Content determination

李 顏(1979-)，女，藥師，碩士.Tel：(021)64369181-8789,E-mail:lycft@163.com.

郭 澄.Tel：(021)64369181-8089,E-mail:gboss@126.com.

R917

A

1006-0111(2011)01-0033-03