付曉春， 徐 哲， 陳建軍

(廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣州 廣東 510600)

縮醛基毛冬青提取化合物R4對(duì)缺氧/復(fù)氧大鼠心肌細(xì)胞的保護(hù)作用*

付曉春△， 徐 哲， 陳建軍

(廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣州 廣東 510600)

目的探討縮醛基毛冬青提取化合物R4對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法采用原代培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞建立缺氧/復(fù)氧損傷模型，實(shí)驗(yàn)分為正常細(xì)胞培養(yǎng)組和缺氧/復(fù)氧損傷模型組、缺氧/復(fù)氧損傷+縮醛基毛冬青提取化合物R4(5、10、20 μmol/L)組和缺氧/復(fù)氧損傷+ verapamil(5 μmol/L)組。用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)的活性，硫代巴比妥酸顯色法測(cè)定丙二醛(MDA)含量，MTT染色法測(cè)定線粒體脫氫酶活性改變，化學(xué)比色法測(cè)定乳酸脫氫酶(LDH)活性變化, Griess法測(cè)定一氧化氮(NO)的含量。結(jié)果縮醛基毛冬青提取化合物R4可顯著提高缺氧/復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞內(nèi)SOD的活性及細(xì)胞內(nèi)線粒體脫氫酶活性，能顯著抑制LDH的活性、MDA的生成以及提高NO的含量,并能明顯抑制心肌細(xì)胞凋亡。結(jié)論縮醛基毛冬青提取化合物R4具有明顯抗缺氧/復(fù)氧損傷、保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。

縮醛基毛冬青提取化合物R4； 心肌細(xì)胞； 超氧化物歧化酶； 丙二醛； 乳酸脫氫酶； 缺氧/復(fù)氧

毛冬青為冬青科植物冬青屬毛冬青(IlexpubescensHook.et Arn)的干燥根，冬青屬是冬青科3個(gè)屬中我國(guó)僅有的1個(gè)屬。毛冬青是我國(guó)南方常用的中藥材，是嶺南地區(qū)的特色中藥材，具有活血通脈、消腫止痛、清熱解毒的功效。目前毛冬青的抗心肌缺血作用主要集中在毛冬青甲素等三萜類化合物的生物活性研究上。我們通過(guò)對(duì)含有縮醛側(cè)鏈的酚酸類成分的深入研究，發(fā)現(xiàn)縮醛基毛冬青提取化合物(acetal hairy holly extractive compound R4,AHHECR4)具有較強(qiáng)的抗心肌缺血的藥理活性。本文擬從細(xì)胞水平進(jìn)行AHHECR4對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制研究，為開(kāi)發(fā)新型抗心肌缺血藥物提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1材料

1.1主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清(fetal bovine serum) 購(gòu)自北京華美試劑公司，噻唑藍(lán)[3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)- 2,5 - diphenylterazolium bromide, MTT]為Sigma產(chǎn)品，AHHECR4(結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1)為沈陽(yáng)藥科大學(xué)化學(xué)合成教研室提供。乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

Figure 1. Structure of AHHECR4.

1.2動(dòng)物 出生后2-3 d大鼠，由廣州市白云區(qū)穗北實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)提供。

1.3儀器 CO2培養(yǎng)箱(NuAir),倒置顯微鏡(LEICA DM IRB)(Leica),CJT808超凈化工作臺(tái)(沈陽(yáng)市醫(yī)療器械二廠),80-1臺(tái)式離心沉淀機(jī)(上海手術(shù)器械廠),酶標(biāo)儀(Bio-Rad)，650-60熒光分光光度計(jì)(HITACHI), FACSAria 流式細(xì)胞儀(BD Biosciences)。

2方法

2.1乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng) 2-3日齡的Wistar乳鼠，用75%乙醇浸泡消毒，剪開(kāi)胸腔取心尖部組織，剪成1 mm×1 mm×1 mm碎塊放入大離心管中，用0.25%胰蛋白酶溶液8 mL，在恒溫振蕩器37 ℃水浴中消化10 min，用吸管吹打組織塊1 min，自然沉淀后，將上清液及沉淀物分別處理。上清液移至另一無(wú)菌離心管中，加入2 mL冷培養(yǎng)基以終止消化，離心10 min，棄上清液。沉淀中加入D-Hanks液6 mL，混懸后離心，充分洗去胰蛋白酶[1-3]。最后用20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，將心肌細(xì)胞制成細(xì)胞懸液備用。沉淀組織塊再加胰蛋白酶消化沉降，其上清重復(fù)上述步驟。沉淀組織反復(fù)消化，直至完全消化為止。上述消化制備的心肌細(xì)胞經(jīng)差速貼壁純化后制成5×108/L的細(xì)胞懸液(細(xì)胞純度達(dá)95%以上)，分裝于25 mL培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，在5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2實(shí)驗(yàn)分組 參照文獻(xiàn)[4-6],取培養(yǎng)4 d的心肌細(xì)胞若干瓶，分為正常細(xì)胞培養(yǎng)組、缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)損傷模型組、H/R+AHHECR4小劑量(5 μmol/L)組、H/R+AHHECR4中劑量(10 μmol/L)組、H/R+AHHECR4大劑量(20 μmol/L)組和H/R+ 陽(yáng)性對(duì)照藥verapamil(5 μmol/L)組。AHHECR4在缺氧及復(fù)氧期均給藥。

2.3缺氧/復(fù)氧模型建立 用不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基充入氮?dú)?純度99.99%)，飽和15 min，置換培養(yǎng)瓶中的正常培養(yǎng)基后，再向瓶?jī)?nèi)充氮30 s，然后旋緊瓶蓋37 ℃培養(yǎng)2 h后，換正常培養(yǎng)基充入95%O2、5% CO2復(fù)氧后培養(yǎng)1 h。

2.4觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

① 心肌細(xì)胞SOD活性及MDA含量測(cè)定 缺氧2 h再給氧1 h，用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD的活力，硫代巴比妥酸顯色法測(cè)定MDA含量。

② 細(xì)胞內(nèi)線粒體脫氫酶活性測(cè)定LDH 缺氧2 h再給氧1 h后，MTT染色法測(cè)定細(xì)胞吸光度(A)值。具體方法如下:細(xì)胞用胰酶消化制成細(xì)胞懸液加入96孔板中,每孔加100 μL，培養(yǎng)24 h后，用D-Hanks液沖洗2次，分別以含20 %胎牛血清的DMEM(正常組)及充氮飽和的無(wú)血清DMEM加入培養(yǎng)板(模型組)，此模型組造成缺氧需在密避容器中進(jìn)行，向密閉容器中充入高純氮?dú)?0 min，2 h后將培養(yǎng)板放入正常條件下培養(yǎng)1 h后，每孔加入5%MTT 20 μL培養(yǎng)4 h后吸去上清，每孔加入DMSO 100μL，振蕩3 min后在酶標(biāo)儀上570 nm測(cè)A值。用藥組在缺氧前及復(fù)氧后均應(yīng)給藥。

③ 培養(yǎng)基質(zhì)LDH活性測(cè)定 缺氧2 h再?gòu)?fù)氧1 h后，按照LDH試劑盒說(shuō)明測(cè)定其含量[7,8]。

④ 一氧化氮(nitric oxide,NO)的測(cè)定 NO化學(xué)性質(zhì)活潑，在體內(nèi)很快轉(zhuǎn)化為硝酸鹽(NO3-)和亞硝酸鹽(NO2-)，而NO2-又進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為NO3-。本法利用Griess試劑將NO3-還原為NO2-，通過(guò)顯色的深淺測(cè)定濃度。在96孔板中，加入100 μL/well培養(yǎng)介質(zhì)與等量的Griess試劑，室溫放置10 min，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀550 nm處測(cè)A值[9]。根據(jù)亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本中的NO2-含量。Griess試劑的配制參照文獻(xiàn)方法[10]。NO的標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：用雙蒸水配制7種不同濃度的亞硝酸鈉溶液25、50、75、100、125、150、175 μmol/L，按上述方法測(cè)A值，以亞硝酸鈉濃度為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

Y=215.91X-12.182，R2=0.9994

⑤ 流式細(xì)胞儀檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率 缺氧2 h再?gòu)?fù)氧1 h后, 以PBS清洗, 加入1 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶 (propidium iodide，PI) 至細(xì)胞懸液中, 輕輕搖勻,置冰浴中反應(yīng)10 min, 加入400 μL預(yù)冷的binding buffer至樣品中, 1 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)[11]。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1心肌細(xì)胞SOD活性及MDA含量測(cè)定

模型組與正常組相比SOD活性顯著降低，MDA含量顯著升高，AHHECR4各劑量組及陽(yáng)性對(duì)照藥verapamil組均可顯著提高H/R心肌細(xì)胞SOD活性,降低MDA的含量,與空白對(duì)照組相比，差異顯著(Plt;0.05或Plt;0.01)，見(jiàn)表1。

表1 AHHECR4對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞的SOD活性及MDA含量的影響

2細(xì)胞內(nèi)線粒體脫氫酶活性測(cè)定

H/R組細(xì)胞A值較對(duì)照組下降(Plt;0.01),而AHHECR4各劑量組( 5、10、20 μmol/L組)及verapamil組A值均較H/R組升高 (Plt;0.01)。A值的大小可以反映細(xì)胞內(nèi)線粒體脫氫酶的活性，提示AHHECR4可提高線粒體脫氫酶的活性，見(jiàn)表2。

表2 AHHECR4對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞內(nèi)A值及培養(yǎng)基質(zhì)LDH活性和NO含量的影響

3培養(yǎng)基質(zhì)LDH活性測(cè)定

與正常組相比，模型組LDH水平顯著升高(Plt; 0.01)，各劑量組AHHECR4及verapamil組均能顯著減少模型組培養(yǎng)介質(zhì)中LDH水平，尤以20 μmol/L最為明顯,見(jiàn)表2。

4NO含量的測(cè)定

H/R造成心肌細(xì)胞代謝率降低，NO水平顯著降低，各劑量組AHHECR4及verapamil能顯著提高心肌細(xì)胞的代謝率，升高模型組培養(yǎng)介質(zhì)中NO水平，見(jiàn)表2。

5流式細(xì)胞儀檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率

與正常組相比,模型組心肌細(xì)胞凋亡率明顯增加,正常細(xì)胞明顯減少(Plt;0.01)；與模型組相比, 給予AHHECR4( 5、10、20 μmol/L)及verapamil預(yù)處理后,心肌細(xì)胞凋亡率明顯減少(Plt;0.05, 或Plt; 0.01),表明AHHECR4及verapamil可明顯抑制心肌細(xì)胞的凋亡, 且在一定范圍內(nèi)隨AHHECR4劑量的增大，表現(xiàn)出量效關(guān)系,見(jiàn)表3。

表3 AHHECR4對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞凋亡率的影響

討 論

心肌細(xì)胞缺氧時(shí)能量代謝障礙、心肌細(xì)胞膜受損。再灌注時(shí), 隨著大量氧的涌入, 產(chǎn)生大量氧自由基, 造成細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化, 生物膜損傷, MDA 是氧自由基攻擊生物膜不飽和脂肪酸的終產(chǎn)物, 其值高低間接反映機(jī)體細(xì)胞受自由基損傷程度; SOD 是一種存在于細(xì)胞液中的抗氧化酶, 它可清除超氧陰離子, 保護(hù)機(jī)體免受超氧陰離子損傷, 其值高低間接反映機(jī)體清除氧自由基的能力[10,11]。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的產(chǎn)物之一，其高低常?？煞从持|(zhì)過(guò)氧化的程度。

研究表明，H/R組與正常對(duì)照組相比SOD活性明顯降低，MDA水平顯著升高，說(shuō)明脂質(zhì)過(guò)氧化劇烈，細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷，而在AHHECR4各給藥組，SOD活性均較H/R組明顯增高，MDA水平低于H/R組，提示AHHECR4可降低心肌細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，提高心肌細(xì)胞清除氧自由基的能力。

體外培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞可因許多因素造成損傷，受損時(shí)生長(zhǎng)、代謝等將受到影響，其中LDH的外漏可作為判斷損傷的重要依據(jù)。LDH釋放量的多少可反映細(xì)胞膜損傷程度。結(jié)果表明AHHECR4可顯著抑制LDH的活性，對(duì)心肌細(xì)胞膜具有保護(hù)作用。

MTT是一種可以進(jìn)入活細(xì)胞的染料。A值反映出心肌細(xì)胞內(nèi)線粒體脫氫酶的活性，同時(shí)還間接反映心肌細(xì)胞的存活情況。AHHECR4可以明顯提高H/R損傷中心肌細(xì)胞線粒體脫氫酶的活性，具有抗H/R線粒體損傷的作用。

近年來(lái)研究表明NO在神經(jīng)、免疫、心血管等系統(tǒng)具有廣泛而復(fù)雜生理與病理作用。NO是一種新型的生物信息遞質(zhì)，具有抗血小板聚集，抑制血管平滑肌細(xì)胞增生等作用，NO生成量減低可能加速心肌缺血的發(fā)生發(fā)作。AHHECR4能使NO生成回升且呈劑量依賴性，從而具有抗心肌缺血的作用。

心肌細(xì)胞的凋亡是缺血性心肌細(xì)胞損傷病變的重要形式之一, 在心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生過(guò)程中, 缺血是細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)者, 再灌注具有加速心肌細(xì)胞凋亡的作用, 而其中氧自由基的形成是再灌注期間組織損傷的病理機(jī)制之一[12]。心肌細(xì)胞H/R損傷的另一個(gè)重要表現(xiàn)是心肌細(xì)胞的凋亡。在本實(shí)驗(yàn)中我們用流式細(xì)胞儀雙標(biāo)法染色, 測(cè)定細(xì)胞凋亡率, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)AHHECR4可明顯抑制心肌細(xì)胞凋亡, 對(duì)H/R 損傷心肌細(xì)胞凋亡有明顯保護(hù)作用。

結(jié)果表明，AHHECR4對(duì)H/R心肌細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用，其作用與verapamil的作用相當(dāng)，其作用機(jī)制可能是通過(guò)提高H/R心肌細(xì)胞內(nèi)SOD的活性，抑制MDA的生成及培養(yǎng)介質(zhì)中LDH的活性, 提高細(xì)胞LDH的活性，并使NO生成回升有關(guān)。

綜上所述，AHHECR4具有明顯的抗H/R損傷，保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。本研究為開(kāi)發(fā)新型抗心肌缺血藥物提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

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EffectsofacetalhairyhollyextractivecompoundR4onratcardiomyocyteinjuryinducedbyhypoxia/reoxygenation

FU Xiao-chun, XU Zhe, CHEN Jian-jun

(GuangdongFoodandDrugVocationalCollege,Guangzhou510600,China.E-mail:fxc1968@163.com)

AIM: To observe the effects of acetal hairy holly extractive compound R4(AHHECR4) on myocardial cell injury induced by hypoxia/reoxygenation.METHODSThe model of rat myocardial cell injury was induced by hypoxia/reoxygenation. The activity of superoxide dismutase (SOD) in the myocardial cells was measured by the method of xanthine oxidase. The content of malondialdehyde (MDA) was determined by the method of thiobarbituric acid. The activity of dehydrogenase (A) in mitochondria was detected by MTT assay. The activity of lactate dehydrogenase(LDH) and the content of NO in the culture medium were also evaluated.RESULTSAHHECR4 at concentrations of 5, 10 and 20 μmol/L remarkably increased SOD activity and the value ofA, and significantly inhibited MDA production and LDH leakage. Greatly increased content of NO in the culture medium was also observed.CONCLUSIONThe results indicate that AHHECR4 has a protective effect on myocardial cells under the condition of hypoxia/reoxygenation injury.

Acetal hairy holly extraction compound R4; Cardiomyocytes; Superoxide dismutase; Malondialdehyde; Lactate dehydrogenase; Hypoxia/reoxygenation

1000-4718(2011)11-2082-04

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.11.007

2011-04-14

2011-09-15

廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.10151052005000014)

△通訊作者 Tel：020-28854983；E-mail: fxc1968@163. com