付曉春， 徐 哲， 陳建軍

(廣東食品藥品職業(yè)學院，廣州 廣東 510600)

縮醛基毛冬青提取化合物R4對缺氧/復氧大鼠心肌細胞的保護作用*

付曉春△， 徐 哲， 陳建軍

(廣東食品藥品職業(yè)學院，廣州 廣東 510600)

目的探討縮醛基毛冬青提取化合物R4對缺氧/復氧損傷心肌細胞的保護作用及其機制。方法采用原代培養(yǎng)的新生大鼠心肌細胞建立缺氧/復氧損傷模型，實驗分為正常細胞培養(yǎng)組和缺氧/復氧損傷模型組、缺氧/復氧損傷+縮醛基毛冬青提取化合物R4(5、10、20 μmol/L)組和缺氧/復氧損傷+ verapamil(5 μmol/L)組。用黃嘌呤氧化酶法測定超氧化物歧化酶(SOD)的活性，硫代巴比妥酸顯色法測定丙二醛(MDA)含量，MTT染色法測定線粒體脫氫酶活性改變，化學比色法測定乳酸脫氫酶(LDH)活性變化, Griess法測定一氧化氮(NO)的含量。結(jié)果縮醛基毛冬青提取化合物R4可顯著提高缺氧/復氧損傷心肌細胞內(nèi)SOD的活性及細胞內(nèi)線粒體脫氫酶活性，能顯著抑制LDH的活性、MDA的生成以及提高NO的含量,并能明顯抑制心肌細胞凋亡。結(jié)論縮醛基毛冬青提取化合物R4具有明顯抗缺氧/復氧損傷、保護心肌細胞的作用。

縮醛基毛冬青提取化合物R4； 心肌細胞； 超氧化物歧化酶； 丙二醛； 乳酸脫氫酶； 缺氧/復氧

毛冬青為冬青科植物冬青屬毛冬青(IlexpubescensHook.et Arn)的干燥根，冬青屬是冬青科3個屬中我國僅有的1個屬。毛冬青是我國南方常用的中藥材，是嶺南地區(qū)的特色中藥材，具有活血通脈、消腫止痛、清熱解毒的功效。目前毛冬青的抗心肌缺血作用主要集中在毛冬青甲素等三萜類化合物的生物活性研究上。我們通過對含有縮醛側(cè)鏈的酚酸類成分的深入研究，發(fā)現(xiàn)縮醛基毛冬青提取化合物(acetal hairy holly extractive compound R4,AHHECR4)具有較強的抗心肌缺血的藥理活性。本文擬從細胞水平進行AHHECR4對缺氧/復氧損傷心肌細胞的保護作用及其機制研究，為開發(fā)新型抗心肌缺血藥物提供堅實的理論基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1材料

1.1主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清(fetal bovine serum) 購自北京華美試劑公司，噻唑藍[3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)- 2,5 - diphenylterazolium bromide, MTT]為Sigma產(chǎn)品，AHHECR4(結(jié)構(gòu)式見圖1)為沈陽藥科大學化學合成教研室提供。乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

Figure 1. Structure of AHHECR4.

1.2動物 出生后2-3 d大鼠，由廣州市白云區(qū)穗北實驗動物養(yǎng)殖場提供。

1.3儀器 CO2培養(yǎng)箱(NuAir),倒置顯微鏡(LEICA DM IRB)(Leica),CJT808超凈化工作臺(沈陽市醫(yī)療器械二廠),80-1臺式離心沉淀機(上海手術(shù)器械廠),酶標儀(Bio-Rad)，650-60熒光分光光度計(HITACHI), FACSAria 流式細胞儀(BD Biosciences)。

2方法

2.1乳鼠心肌細胞培養(yǎng) 2-3日齡的Wistar乳鼠，用75%乙醇浸泡消毒，剪開胸腔取心尖部組織，剪成1 mm×1 mm×1 mm碎塊放入大離心管中，用0.25%胰蛋白酶溶液8 mL，在恒溫振蕩器37 ℃水浴中消化10 min，用吸管吹打組織塊1 min，自然沉淀后，將上清液及沉淀物分別處理。上清液移至另一無菌離心管中，加入2 mL冷培養(yǎng)基以終止消化，離心10 min，棄上清液。沉淀中加入D-Hanks液6 mL，混懸后離心，充分洗去胰蛋白酶[1-3]。最后用20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，將心肌細胞制成細胞懸液備用。沉淀組織塊再加胰蛋白酶消化沉降，其上清重復上述步驟。沉淀組織反復消化，直至完全消化為止。上述消化制備的心肌細胞經(jīng)差速貼壁純化后制成5×108/L的細胞懸液(細胞純度達95%以上)，分裝于25 mL培養(yǎng)瓶內(nèi)，在5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2實驗分組 參照文獻[4-6],取培養(yǎng)4 d的心肌細胞若干瓶，分為正常細胞培養(yǎng)組、缺氧/復氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)損傷模型組、H/R+AHHECR4小劑量(5 μmol/L)組、H/R+AHHECR4中劑量(10 μmol/L)組、H/R+AHHECR4大劑量(20 μmol/L)組和H/R+ 陽性對照藥verapamil(5 μmol/L)組。AHHECR4在缺氧及復氧期均給藥。

2.3缺氧/復氧模型建立 用不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基充入氮氣(純度99.99%)，飽和15 min，置換培養(yǎng)瓶中的正常培養(yǎng)基后，再向瓶內(nèi)充氮30 s，然后旋緊瓶蓋37 ℃培養(yǎng)2 h后，換正常培養(yǎng)基充入95%O2、5% CO2復氧后培養(yǎng)1 h。

2.4觀察指標及檢測方法

① 心肌細胞SOD活性及MDA含量測定 缺氧2 h再給氧1 h，用黃嘌呤氧化酶法測定SOD的活力，硫代巴比妥酸顯色法測定MDA含量。

② 細胞內(nèi)線粒體脫氫酶活性測定LDH 缺氧2 h再給氧1 h后，MTT染色法測定細胞吸光度(A)值。具體方法如下:細胞用胰酶消化制成細胞懸液加入96孔板中,每孔加100 μL，培養(yǎng)24 h后，用D-Hanks液沖洗2次，分別以含20 %胎牛血清的DMEM(正常組)及充氮飽和的無血清DMEM加入培養(yǎng)板(模型組)，此模型組造成缺氧需在密避容器中進行，向密閉容器中充入高純氮氣20 min，2 h后將培養(yǎng)板放入正常條件下培養(yǎng)1 h后，每孔加入5%MTT 20 μL培養(yǎng)4 h后吸去上清，每孔加入DMSO 100μL，振蕩3 min后在酶標儀上570 nm測A值。用藥組在缺氧前及復氧后均應(yīng)給藥。

③ 培養(yǎng)基質(zhì)LDH活性測定 缺氧2 h再復氧1 h后，按照LDH試劑盒說明測定其含量[7,8]。

④ 一氧化氮(nitric oxide,NO)的測定 NO化學性質(zhì)活潑，在體內(nèi)很快轉(zhuǎn)化為硝酸鹽(NO3-)和亞硝酸鹽(NO2-)，而NO2-又進一步轉(zhuǎn)化為NO3-。本法利用Griess試劑將NO3-還原為NO2-，通過顯色的深淺測定濃度。在96孔板中，加入100 μL/well培養(yǎng)介質(zhì)與等量的Griess試劑，室溫放置10 min，在酶聯(lián)免疫檢測儀550 nm處測A值[9]。根據(jù)亞硝酸鈉標準曲線計算樣本中的NO2-含量。Griess試劑的配制參照文獻方法[10]。NO的標準曲線的制備：用雙蒸水配制7種不同濃度的亞硝酸鈉溶液25、50、75、100、125、150、175 μmol/L，按上述方法測A值，以亞硝酸鈉濃度為橫坐標，A值為縱坐標，繪制標準曲線。

Y=215.91X-12.182，R2=0.9994

⑤ 流式細胞儀檢測心肌細胞凋亡率 缺氧2 h再復氧1 h后, 以PBS清洗, 加入1 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶 (propidium iodide，PI) 至細胞懸液中, 輕輕搖勻,置冰浴中反應(yīng)10 min, 加入400 μL預(yù)冷的binding buffer至樣品中, 1 h內(nèi)上機檢測[11]。

3統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1心肌細胞SOD活性及MDA含量測定

模型組與正常組相比SOD活性顯著降低，MDA含量顯著升高，AHHECR4各劑量組及陽性對照藥verapamil組均可顯著提高H/R心肌細胞SOD活性,降低MDA的含量,與空白對照組相比，差異顯著(Plt;0.05或Plt;0.01)，見表1。

表1 AHHECR4對缺氧/復氧損傷心肌細胞的SOD活性及MDA含量的影響

2細胞內(nèi)線粒體脫氫酶活性測定

H/R組細胞A值較對照組下降(Plt;0.01),而AHHECR4各劑量組( 5、10、20 μmol/L組)及verapamil組A值均較H/R組升高 (Plt;0.01)。A值的大小可以反映細胞內(nèi)線粒體脫氫酶的活性，提示AHHECR4可提高線粒體脫氫酶的活性，見表2。

表2 AHHECR4對缺氧/復氧損傷心肌細胞內(nèi)A值及培養(yǎng)基質(zhì)LDH活性和NO含量的影響

3培養(yǎng)基質(zhì)LDH活性測定

與正常組相比，模型組LDH水平顯著升高(Plt; 0.01)，各劑量組AHHECR4及verapamil組均能顯著減少模型組培養(yǎng)介質(zhì)中LDH水平，尤以20 μmol/L最為明顯,見表2。

4NO含量的測定

H/R造成心肌細胞代謝率降低，NO水平顯著降低，各劑量組AHHECR4及verapamil能顯著提高心肌細胞的代謝率，升高模型組培養(yǎng)介質(zhì)中NO水平，見表2。

5流式細胞儀檢測心肌細胞凋亡率

與正常組相比,模型組心肌細胞凋亡率明顯增加,正常細胞明顯減少(Plt;0.01)；與模型組相比, 給予AHHECR4( 5、10、20 μmol/L)及verapamil預(yù)處理后,心肌細胞凋亡率明顯減少(Plt;0.05, 或Plt; 0.01),表明AHHECR4及verapamil可明顯抑制心肌細胞的凋亡, 且在一定范圍內(nèi)隨AHHECR4劑量的增大，表現(xiàn)出量效關(guān)系,見表3。

表3 AHHECR4對缺氧/復氧損傷心肌細胞凋亡率的影響

討 論

心肌細胞缺氧時能量代謝障礙、心肌細胞膜受損。再灌注時, 隨著大量氧的涌入, 產(chǎn)生大量氧自由基, 造成細胞膜脂質(zhì)過氧化, 生物膜損傷, MDA 是氧自由基攻擊生物膜不飽和脂肪酸的終產(chǎn)物, 其值高低間接反映機體細胞受自由基損傷程度; SOD 是一種存在于細胞液中的抗氧化酶, 它可清除超氧陰離子, 保護機體免受超氧陰離子損傷, 其值高低間接反映機體清除氧自由基的能力[10,11]。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物之一，其高低常?？煞从持|(zhì)過氧化的程度。

研究表明，H/R組與正常對照組相比SOD活性明顯降低，MDA水平顯著升高，說明脂質(zhì)過氧化劇烈，細胞受到嚴重損傷，而在AHHECR4各給藥組，SOD活性均較H/R組明顯增高，MDA水平低于H/R組，提示AHHECR4可降低心肌細胞脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，提高心肌細胞清除氧自由基的能力。

體外培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞可因許多因素造成損傷，受損時生長、代謝等將受到影響，其中LDH的外漏可作為判斷損傷的重要依據(jù)。LDH釋放量的多少可反映細胞膜損傷程度。結(jié)果表明AHHECR4可顯著抑制LDH的活性，對心肌細胞膜具有保護作用。

MTT是一種可以進入活細胞的染料。A值反映出心肌細胞內(nèi)線粒體脫氫酶的活性，同時還間接反映心肌細胞的存活情況。AHHECR4可以明顯提高H/R損傷中心肌細胞線粒體脫氫酶的活性，具有抗H/R線粒體損傷的作用。

近年來研究表明NO在神經(jīng)、免疫、心血管等系統(tǒng)具有廣泛而復雜生理與病理作用。NO是一種新型的生物信息遞質(zhì)，具有抗血小板聚集，抑制血管平滑肌細胞增生等作用，NO生成量減低可能加速心肌缺血的發(fā)生發(fā)作。AHHECR4能使NO生成回升且呈劑量依賴性，從而具有抗心肌缺血的作用。

心肌細胞的凋亡是缺血性心肌細胞損傷病變的重要形式之一, 在心肌細胞凋亡的發(fā)生過程中, 缺血是細胞凋亡的誘導者, 再灌注具有加速心肌細胞凋亡的作用, 而其中氧自由基的形成是再灌注期間組織損傷的病理機制之一[12]。心肌細胞H/R損傷的另一個重要表現(xiàn)是心肌細胞的凋亡。在本實驗中我們用流式細胞儀雙標法染色, 測定細胞凋亡率, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)AHHECR4可明顯抑制心肌細胞凋亡, 對H/R 損傷心肌細胞凋亡有明顯保護作用。

結(jié)果表明，AHHECR4對H/R心肌細胞損傷具有一定的保護作用，其作用與verapamil的作用相當，其作用機制可能是通過提高H/R心肌細胞內(nèi)SOD的活性，抑制MDA的生成及培養(yǎng)介質(zhì)中LDH的活性, 提高細胞LDH的活性，并使NO生成回升有關(guān)。

綜上所述，AHHECR4具有明顯的抗H/R損傷，保護心肌細胞的作用。本研究為開發(fā)新型抗心肌缺血藥物提供了堅實的理論基礎(chǔ)。

[1] 徐叔云，卞如濂，陳 修.藥理實驗方法學[M].第2版.北京:人民衛(wèi)生出版社，1991.531.

[2] 呂雄文，李 俊，金 涌，等.卡托普利和阿司匹林相互作用對培養(yǎng)乳鼠心肌細胞損傷的影響其機制探討[J].中國藥理學通報，2002,18(3): 308-311.

[3] 陳夢飛,陸大祥,戚仁斌，等.甘氨酸脂質(zhì)體的制備及其對心肌細胞缺氧/復氧損傷的影響[J].中國病理生理雜志，2006,22(4):670-673.

[4] 王興祥，周利龍,丁家望，等.腺苷對缺氧/復氧心肌細胞的保護作用[J].生理學報，2003,55(1): 47-52.

[5] 朱智彤，姚 智，李會強，等.葛根素對乳鼠心肌細胞缺氧-復氧時脂質(zhì)過氧化損傷的保護作用[J].中草藥，2002,33(4): 343-346.

[6] Kirshenbaum LA ,Singal PK.Changes in antioxide enzyme in isolated cardiac myocytes subjected to hypoxia-reoxygenation [J].Lab Invest, 1992, 67(6): 796-803.

[7] 宋麗杰,付潤芳，王振基，等.PGE1對培養(yǎng)乳鼠心肌細胞缺氧/復氧損傷的保護作用[J].中國藥理學通報,2003,19(10): 1140-1142.

[8] 劉 丹,何 明,易 波,等.p38 MAPK- Pim-3通路可能介導預(yù)處理對抗心肌細胞缺氧 /復氧損傷[J].中國病理生理雜志,2009,25(10):1912-1916.

[9] Grykiewicz G,Poenic M,Tsien RY.A new generation of Ca2+indicators with greatly improved fluorescence properties[J].J Biol Chem,1985,260(6): 3440-3450.

[10]Zweier JL, Rayburn BK, Flaherty JT, et al. Recombinant superoxide dismutase reduce free radical contractions in reperfused myocardium[J]. J Clin Invest,1987,80(6):1728-1739.

[11]閔 清, 白育庭, 余 薇，等.黃芪多糖對乳鼠心肌細胞缺氧/復氧損傷的保護作用[J].中國藥理學通報，2010,26(12): 1661-1664.

[12]Gao F,Gong B,Christopher TA,et al.Anti-apoptotic effect of benidipine,a long-lasting vasodilating calcium antagonist, in ischemic/reperfused myocardial cells[ J]. Br J Pharmacol,2001,132(4):869-878.

EffectsofacetalhairyhollyextractivecompoundR4onratcardiomyocyteinjuryinducedbyhypoxia/reoxygenation

FU Xiao-chun, XU Zhe, CHEN Jian-jun

(GuangdongFoodandDrugVocationalCollege,Guangzhou510600,China.E-mail:fxc1968@163.com)

AIM: To observe the effects of acetal hairy holly extractive compound R4(AHHECR4) on myocardial cell injury induced by hypoxia/reoxygenation.METHODSThe model of rat myocardial cell injury was induced by hypoxia/reoxygenation. The activity of superoxide dismutase (SOD) in the myocardial cells was measured by the method of xanthine oxidase. The content of malondialdehyde (MDA) was determined by the method of thiobarbituric acid. The activity of dehydrogenase (A) in mitochondria was detected by MTT assay. The activity of lactate dehydrogenase(LDH) and the content of NO in the culture medium were also evaluated.RESULTSAHHECR4 at concentrations of 5, 10 and 20 μmol/L remarkably increased SOD activity and the value ofA, and significantly inhibited MDA production and LDH leakage. Greatly increased content of NO in the culture medium was also observed.CONCLUSIONThe results indicate that AHHECR4 has a protective effect on myocardial cells under the condition of hypoxia/reoxygenation injury.

Acetal hairy holly extraction compound R4; Cardiomyocytes; Superoxide dismutase; Malondialdehyde; Lactate dehydrogenase; Hypoxia/reoxygenation

1000-4718(2011)11-2082-04

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.11.007

2011-04-14

2011-09-15

廣東省自然科學基金資助項目(No.10151052005000014)

△通訊作者 Tel：020-28854983；E-mail: fxc1968@163. com