孫愛麗, 胡曉燕, 關(guān)廣聚△, 鄧浩萍, 劉元濤, 陳詩鴻, 劉軍莉, 鄧景惕

(1山東大學(xué)第二醫(yī)院, 山東 濟(jì)南 250033; 2山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室, 山東 濟(jì)南 250012;3萊州市人民醫(yī)院, 山東 萊州 261419)

·短篇論著·

尿胞外體亮氨酸氨基肽酶及二肽基肽酶在糖尿病腎病中的變化*

孫愛麗1, 胡曉燕2, 關(guān)廣聚1△, 鄧浩萍3, 劉元濤1, 陳詩鴻1, 劉軍莉1, 鄧景惕2

(1山東大學(xué)第二醫(yī)院, 山東 濟(jì)南 250033;2山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室, 山東 濟(jì)南 250012;3萊州市人民醫(yī)院, 山東 萊州 261419)

目的探討 2 型糖尿病患者尿液胞外體的亮氨酸氨基肽酶(exosome - LAP)及二肽基肽酶4(exosome - DPP4)的水平變化在糖尿病腎病發(fā)展過程中的意義。方法選取 127 例 2 型糖尿病患者，根據(jù) 24 h 尿白蛋白肌酐比(UACR)分為糖尿病正常白蛋白尿組(DM, 43 例)、微量白蛋白尿組(DN1, 50 例)和大量白蛋白尿組(DN2, 34 例)。另選健康對(duì)照組 34 例。采用特異性的單克隆抗體提純胞外體，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)尿液胞外體的 exosome - LAP 和exosome - DPP4 。同時(shí)檢測(cè)糖化血江蛋白(HbA1c)、血膽固醇(CH)、肌酐(CR)、尿素氮(BUN)。應(yīng)用多元逐步回歸方法分析 DPP4 及 LAP 與 HbA1c、CH、UACR、CR、BUN 相關(guān)性。結(jié)果DM、DN1、DN2 組 exosome - LAP和exosome - DPP4 水平均顯著高于正常組(均Plt;0.01)；與 DM 組比較，DN2 組 exosome - LAP水平顯著升高(Plt;0.01)。尿 exosome - LAP、 exosome - DPP4 與 HbA1c、CH、UACR、CR、BUN 顯著相關(guān)。逐步多元回歸分析顯示，CH、UACR 是 exosome - LAP 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(均Plt;0.01)；UACR、HbA1c 是 exosome - DPP4 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(均Plt;0.01)。結(jié)論Exosome - LAP和exosome - DPP4 水平與糖尿病腎病嚴(yán)重程度密切相關(guān)，以上指標(biāo)對(duì)于糖尿病腎病的診斷及預(yù)后估計(jì)具有一定臨床價(jià)值。

糖尿病腎?。?白蛋白尿； 尿胞外體； 亮氨酸氨肽酶； 二肽基肽酶4

2 型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)是一種花費(fèi)高且發(fā)病率高的疾病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，20 歲以上的美國(guó)人群估計(jì)有2 350 萬人患病，占該人群的 10.7%。預(yù)計(jì)到 2021 年，糖尿病患病率將占該人群的 13.5%,至 2031 年可達(dá)到 14.5%[1]。糖尿病腎病作為糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥，其早期診斷與治療已成為臨床工作面臨的重要課題。尿中的胞外體是多泡體的內(nèi)部小泡，包含膜和胞漿蛋白，主要來源于近曲腎小管上皮細(xì)胞[2]。正常人尿胞外體蛋白占尿總蛋白量近 3%[3]。近來，關(guān)于尿胞外體與腎臟損傷相關(guān)性的研究已成為生物醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一[4]。然而，關(guān)于尿胞外體與糖尿病腎病的關(guān)系目前尚不明確。本研究將探討尿胞外體與糖尿病腎病各指標(biāo)間的相關(guān)性，以期發(fā)現(xiàn)用于糖尿病腎病早期診斷及預(yù)后估計(jì)的特異性生物學(xué)標(biāo)志物。

材 料 和 方 法

1對(duì)象

1.1臨床資料 127 例年齡大于 30 歲的T2DMM病人來自 2009 年 1月-10 月我院內(nèi)分泌科及腎病科門診及病房，根據(jù)尿白蛋白肌酐比(urinary albumin / creatinine ratio,UACR)分為糖尿病無腎病組(DM,43 例 UACR lt; 30 mg/g 肌酐)、微量白蛋白尿組(DN1,50例 30 mg/g 肌酐≤ UACR lt; 300 mg/g 肌酐)和臨床白蛋白尿組(DN2,34 例 UACR≥300 mg/g 肌酐)。健康對(duì)照組 34 例，所有患者均排除糖尿病急性并發(fā)癥(糖尿病酮癥酸中毒、高滲非酮癥昏迷及感染)、糖尿病并發(fā)嚴(yán)重心、肝、腎功能不全(尿毒癥)及惡性腫瘤、風(fēng)濕性疾病。

1.2基礎(chǔ)治療 (1)糖尿病低鹽低脂飲食，保證能量供應(yīng)；(2)胰島素控制血糖；(3)糾正代謝紊亂；(4)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑或血管緊張素受體拮抗劑控制高血壓，使血壓在 140/90 mmHg 以內(nèi)；(5)保護(hù)腎功能。

1.3檢測(cè)指標(biāo) 過夜空腹 10 h,抽取靜脈血，糖化血紅蛋白(glycated hemoglobin, HbA1c)、血肌酐(creatinine,CR)、膽固醇(cholesterol,CH)、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、尿肌酐的測(cè)定皆由日立 7170 S全自動(dòng)生化分析儀完成。檢測(cè)肌酐采用苦味酸法(購(gòu)自貝克曼公司)，尿素氮采用速率法(購(gòu)自貝克曼公司)，膽固醇采用化學(xué)修飾法(購(gòu)自浙江東歐公司)，糖化血紅蛋白采用液相色譜法(日本東曹公司原裝進(jìn)口)。尿白蛋白的測(cè)定由芬蘭 Quickread 101 分析儀完成,結(jié)果采用 UACR 報(bào)告。

2方法

2.1尿液標(biāo)本選擇 緩沖液的配制：1 mol/L Tris-HCl 尿液中性緩沖液,加 1% NaN3,使 pH 值為 7.5 (20×)。在尿液中最終濃度：50 mmol/L Tris-HCl,pH 7.5, 0.005% NaN3。 從161 例病人 24 h 均勻混合尿液中收集 950 μL,加 50 μL 緩沖液，立即放 -80 ℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.2胞外體抗體板的準(zhǔn)備 羊抗鼠抗體用 Tris 緩沖液(10 mmol/L Tris, 10 mmol/L NaCl和10 mmol/L NaN3,pH 8.5)稀釋成濃度為 10 mg/L 。把稀釋的抗體鋪加 96 孔板上(50 μL/well)， 37 ℃ 環(huán)境中孵育使板干燥，然后用 PBST 洗板 1 次。用 50 mmol/L Tris-HCl (含 150 mmol/L NaCl)緩沖液稀釋抗胞外體抗體,使?jié)舛葹?20 mg/L，每孔加 50 μL 置 4 ℃ 過夜。 每孔加 250 μL PBS 酪蛋白阻滯劑，常溫下孵育 1 h備用。

2.3尿胞外體二肽基肽酶 4(exosomal dipeptidyl peptidase 4, exosome - DPP4)和胞外體亮氨酸基肽酶(exosomal leucine aminopeptidase,exosome - LAP)的檢測(cè)

①尿exosome - DPP4 的檢測(cè) 用 PBST 緩沖液(PBS 加 0.05% 吐溫 20)洗抗體板 1 次，然后每孔加50 μL 尿液，37 ℃ 孵育3 h，用 PBST 洗4次， 每孔加 50 μL DPP4 底物溶液(71 mmol/L甘氨酸， pH 8.7 的緩沖液加 0.5 g/L Gly - Pro - pNA)，37 ℃孵育 2 h，每孔加 25 μL 終止液，在 405 nm 波長(zhǎng)讀取A值。

② 尿 exosome - LAP 的檢測(cè) 用 PBS 洗胞外體抗體板 1 次，然后每孔加 50 μL 尿液，37 ℃ 孵育 3 h， PBST 洗 4 次， 每孔加 50 μL LAP 底物(50 mmol/L Tris, pH 7.2 的緩沖液加1 g/L LAP - pNA)， 37 ℃ 孵育 2 h，然后在 405 nm 波長(zhǎng)讀A值。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1一般資料分析

通過表1我們看出各組病例年齡及性別、體重指數(shù)構(gòu)成比無顯著差異。 DM、DN1、DN2 組的 HbA1c 顯著高于健康對(duì)照組(Plt;0.05)，其余各組間無顯著差異。DN2 組血肌酐和尿白蛋白肌酐比明顯高于正常組及 DM、DN1組(Plt;0.01)。DN2 組血壓顯著高于正常組及 DM 組(Plt;0.05)。

2尿酶的變化分析

從表2可以看出 DM、DN1、DN2 組 exosome - LAP 水平顯著高于正常對(duì)照組(Plt;0.01)；DN2 組 exosome - LAP 水平顯著高于 DM 及 DN1 組(均Plt;0.01)； DM、DN1、DN2 組 exosome - DPP4 水平顯著高于正常對(duì)照組(Plt;0.01)，DN2 組顯著高于 DM、DN1 組(Plt;0.01)。

表1 觀察病例的臨床特征

表2 尿胞外體亮氨酸氨基肽酶和二肽基肽酶 4的變化

3尿exosome-LAP及exosome-DPP4與糖脂代謝及UACR的相關(guān)性分析

3.1單變量相關(guān)分析 尿exosome-DPP4與HbA1c(r=0.267,Plt;0.01)、CH(r=0.214,Plt; 0.05)、UACR(r=0.698,Plt;0.01)、CR(r=0.360,Plt;0.01)、BUN(r=0.286,P=0.01) 明顯相關(guān);exosome-LAP與HbA1c(r=0.322,Plt;0.01)、CH(r=0.362,Plt;0.01)、UACR(r=0.706,Plt;0.01)、CR(r=0.428,Plt;0.01)、BUN(r=0.242,Plt;0.01)明顯相關(guān)。圖1、2顯示exosome-DPP4、exosome-LAP與UACR的相關(guān)關(guān)系散點(diǎn)圖。

3.2逐步多元回歸分析 以exosome-LAP和exosome-DPP4 為應(yīng)變量，以HbA1c、CH、UACR、CR和BUN為自變量進(jìn)行逐步多元回歸分析，從表3看出，CH和UACR是exosome-LAP的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(β=0.155,Plt;0.05; β=0.606，Plt;0.01)，UACR和HbA1c是exosome-DPP4的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可見UACR同時(shí)是exosome-LAP和exosome-DPP4 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(β=0.524,Plt;0.01; β=0.499,Plt;0.01)。

Figure 1. Correlation analysis between exosome-DDP4 and UACR level in all subjects. Plt;0.01.

Figure 2. Correlation analysis between exosome-LAP and UACR level in all subjects. Plt;0.01.

表3 酶與糖脂代謝及腎功能、尿白蛋白排泄率的回歸分析

討 論

尿液胞外體成分復(fù)雜， Pisitkun等[5]通過質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)尿液胞外體有 295 種蛋白與腎病及系統(tǒng)性疾病有關(guān)。本研究通過特異性胞外體單克隆抗體提純尿液中的胞外體，發(fā)現(xiàn)隨著尿白蛋白的增加，尿液胞外體的 LAP 及 DPP4 量逐漸增加。

LAP 是尿酶的組成成分之一，為細(xì)胞內(nèi)溶酶體水解酶，能水解肽鏈 N 端由亮氨酸與其它氨基酸形成的肽鍵，廣泛分布于腎、肝、結(jié)締組織、唾液腺等組織中。在腎臟， LAP 主要位于腎小管上皮細(xì)胞的溶酶體內(nèi)。Deng等[6]進(jìn)一步研究認(rèn)為， LAP 主要來源于腎小管近曲小管。正常尿中 LAP 含量甚微。病理情況下，由于各種原因?qū)е履I實(shí)質(zhì)尤其是腎小管損害，引起大量 LAP 通過尿排出。

DPP4 是一種相對(duì)分子質(zhì)量為 110 000 的外肽酶， 能夠水解多肽 N 端倒數(shù)第 2 位的 L - 脯氨酸或 L - 甘氨酸，產(chǎn)生 N 端二肽，多分布于小腸和腎臟刷狀緣膜、肝細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，并釋放于血漿中。DPP4 是絲氨酸膜蛋白酶家族的典型代表[7]，能裂解多種趨化因子、生長(zhǎng)因子、神經(jīng)肽和激素，從而調(diào)節(jié)它們的生物學(xué)功能[8]。 DPP4 與糖尿病關(guān)系密切，在體內(nèi)快速降解胰高血糖素樣肽 - 1和葡萄糖依賴的促胰島素樣多肽，使其失活[9，10]。2007 年、2008 年先后進(jìn)行 DPP4 抑制劑對(duì) 2 型糖尿病患者治療的有效性及安全性分析的研究證明， DPP4 抑制劑可用來改善 2 型糖尿病患者的高血糖水平[11，12]。李文斌等[13]認(rèn)為 DPP4 可導(dǎo)致胰島素樣生長(zhǎng)因子、血小板源生長(zhǎng)因子及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β 等腎臟局部生長(zhǎng)因子表達(dá)增加，刺激腎系膜細(xì)胞增殖、系膜外基質(zhì)沉積增加，導(dǎo)致腎小球基底膜增厚，引起腎小球病變。

本研究結(jié)果表明，T2DM各亞組與健康對(duì)照組比較，尿 LAP 及 DPP4 顯著升高，且升高程度與腎臟損傷程度呈正相關(guān)。此外，特別需要指出的是，本研究發(fā)現(xiàn)T2DM患者在出現(xiàn)微量白蛋白尿之前尿 exosome - LAP和exosome - DPP4 已顯著升高。以上結(jié)果提示此兩項(xiàng)檢查不但可作為糖尿病腎病早期篩選指標(biāo)，而且可作為糖尿病腎病預(yù)后估計(jì)的指標(biāo)。本研究結(jié)果為糖尿病腎病的早期篩選提供了一種方便、經(jīng)濟(jì)的非侵入性新方法，具有臨床推廣意義。

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Changesofurinaryexosomalleucineaminopeptidaseanddipeptidylpeptidase4indiabeticnephropathy

SUN Ai-li1, HU Xiao-yan2, GUAN Guang-ju1, DENG Hao-ping3, LIU Yuan-tao1, CHEN Shi-hong1, LIU Jun-li1, DENG Jing-ti2

(1TheSecondHospitalofShandongUniversity,Jinan250033,China;2DepartmentofBiochemistry,SchoolofMedicine,ShandongUniversity,Jinan250012,China;3LaizhouPeople’sHospital,Laizhou261419,China.E-mail:guangj@sdu.edu.cn)

AIM: To investigate the changes of urinary exosomal enzymes and the correlation with diabetic nephropathy.METHODSThirty-four healthy volunteers and 127 patients of type 2 diabetes mellitus (T2DM) were included in the study. The healthy volunteers served as control. The patients with T2DM were divided into 3 groups based on their 24 h urinary albumin/creatinine ratio (UACR): 50 patients with microalbuminuria in early DN group (DN1), 34 patients with macroalbuminuria in overt DN group (DN2) and 43 patients without albuminuria in DM group. The levels of urine exosomal leucine aminopeptidase(exosome-LAP) and exosomal dipeptidyl peptidase 4(exosome-DPP4) were determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The following methods were used to determine the biochemical parameters: liquid chromatography for glycated hemoglobin (HbA1c), chemical modification method for cholesterol (CH), Jaffe-kinetic assay for creatinine (CR) and urease-GLDH method for blood urea nitrogen (BUN). Multiple stepwise linear regressions were used to analyze the relationship of exosome-LAP or exosome-DPP4 with HbA1c, CH, UACR, CR and BUN.RESULTSThe levels of exosome-LAP and exosome-DPP4 in DM, DN1 and DN2 groups were significantly higher than those in control group (Plt;0.01). The exosome-LAP in DN2 group was significantly higher than that in DM group. Correlation analysis showed that the levels of urinary exosome-LAP and exosome-DPP4 were positively correlated with HbA1c, CH, UACR, CR and BUN. Multiple stepwise linear regression analysis showed that CH and UACR were independent determinants for exosome-LAP (Plt;0.01), and UACR and HbA1c were independent determinants for exosome-DPP4 (Plt;0.01).CONCLUSIONUrine exosome-LAP and exosome-DPP4 are correlated with the severity of diabetic nephropathy. These parameters may serve as clinical markers for the diagnosis and prognosis evaluation of diabetic nephropathy.

Diabetic nephropathies; Albuminuria; Urinary exosomes; Leucine aminopeptidase; Dipeptidyl peptidase 4

1000-4718(2011)04-0775-04

R58

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.04.029

2010-06-16

2011-01-28

山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.ZR2009CM061)

△通訊作者 Tel: 0531-85875004; E-mail:guangj@sdu.edu.cn