鮮振宇， 王 磊， 任東林， 陳典克， 刁德昌， 宋順心， 黃清華， 汪建平

(中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院胃腸病研究所， 廣東 廣州 510655)

ERK5基因-322G/T多態(tài)性與散發(fā)性結(jié)直腸癌易感性的關(guān)系

鮮振宇， 王 磊， 任東林， 陳典克， 刁德昌， 宋順心， 黃清華， 汪建平△

(中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院胃腸病研究所， 廣東 廣州 510655)

目的探討有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路ERK5基因-322G/T(rs3866958)單核苷酸多態(tài)性與中國(guó)華南地區(qū)散發(fā)性結(jié)直腸癌(CRC)易感性的關(guān)系。方法采用Taqman-MGB熒光探針?lè)z測(cè)華南地區(qū)835例腸癌和908例正常對(duì)照的ERK5基因-322G/T單個(gè)核苷酸的多態(tài)性。結(jié)果ERK5基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)-322G/T等位基因在結(jié)直腸癌患者和健康對(duì)照人群中分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)，但在BMI≥24 kg/m2的肥胖人群中-322G/T的分布差異顯著，與GG基因型相比，GT、TT基因型攜帶者的CRC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)下降42.4%(OR=0.576, 95%CI0.413-0.804，Plt;0.01)。結(jié)論ERK5基因-322G/T單核苷酸多態(tài)性與結(jié)直腸癌發(fā)病無(wú)明顯相關(guān)性，但可顯著降低肥胖患者發(fā)病風(fēng)險(xiǎn);-322T基因型是中國(guó)南方人群散發(fā)性結(jié)直腸癌肥胖患者的獨(dú)立保護(hù)因素。

結(jié)直腸腫瘤； 細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶 5； 多態(tài)性，單核苷酸

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一。近年來(lái)隨著食物結(jié)構(gòu)和生活方式的改變，我國(guó)的結(jié)直腸癌發(fā)病率和死亡率呈逐年上升的趨勢(shì)[1],已超越胃癌成為我國(guó)第二大癌癥。結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，現(xiàn)一般認(rèn)為其發(fā)病是環(huán)境因素(飲食習(xí)慣、腸道細(xì)菌等)與內(nèi)在因素(基因變異、癌前病變)相互作用的一個(gè)復(fù)雜而漫長(zhǎng)的過(guò)程。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)標(biāo)記(主要指基因組單個(gè)核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態(tài)性)是否會(huì)引起基因蛋白表達(dá)差異甚至導(dǎo)致疾病日益受到重視。近年來(lái)，隨著大量的SNP位點(diǎn)的檢出，其與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、化療耐藥性及預(yù)后等方面的相關(guān)性日益受到關(guān)注。

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是一個(gè)多基因家族，能被各種細(xì)胞外信號(hào)激活[2]。通過(guò)MAPK信號(hào)通路級(jí)聯(lián)反應(yīng)，外部環(huán)境信號(hào)被傳遞到細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核內(nèi)，引起細(xì)胞合成相應(yīng)的蛋白從而對(duì)外環(huán)境的變化作出反應(yīng)。目前在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中已鑒定出4條MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路：細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶 1/2(extracellular signal- regulated kinase1/2,ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、 p38 MAPK和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶5 (extracellular signal-regulated kinase，ERK5)。ERK5是其中最新的一條通路，是MAPK家族的重要組成部分。國(guó)外已有文獻(xiàn)報(bào)道ERK5通路與乳腺癌、肝癌、肺癌及前列腺癌、良性前列腺增生癥等疾病的相關(guān)性，但尚未有ERK5基因 SNP與結(jié)直腸癌關(guān)聯(lián)性的報(bào)道。所以本研究擬采用 Taqman -MGB熒光探針?lè)ㄊ状翁接慐RK5基因-322G/T單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)與結(jié)直腸癌的相關(guān)性。

材 料 和 方 法

1材料

1.1主要儀器與試劑 ABI7500實(shí)時(shí)定量熒光PCR儀(ABI，No. 275004365)；ABI 3730 DNA測(cè)序儀(ABI)。Taqman Universal PCR Master Mix(ABI)；血液基因組抽提試劑盒(北京天根生化科技公司)；1×TE緩沖液(1 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA,pH 8.0)；測(cè)序引物由上海Invitrogen合成；2×GoTaq Master Mix (Promega)；PCR引物純化試劑盒(Promega)。

1.2病人資料 病例組選自2002年7月-2010年2月在廣州6個(gè)臨床中心就診的835例結(jié)直腸癌患者，均經(jīng)組織病理學(xué)確診，病例組對(duì)象納入標(biāo)準(zhǔn)包括：華南地區(qū)漢族人群，無(wú)血緣關(guān)系。剔除標(biāo)準(zhǔn)為家族性腺瘤性息肉病和遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌。對(duì)照組為同時(shí)期同一地區(qū)無(wú)血緣關(guān)系的健康體檢人群，均為漢族，共908例，對(duì)照組與病例組按年齡(±5歲)和性別上相匹配。所有參與實(shí)驗(yàn)者均簽署知情同意書(shū)，并獲中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2方法

2.1基因組DNA提取 按常規(guī)蛋白酶K消化、苯酚/氯仿抽提、乙醇沉淀法提取外周血白細(xì)胞基因組DNA，pH 8.0 TE溶解，-20 ℃保存。部分DNA按照實(shí)驗(yàn)要求濃度稀釋至10 mg/L,-4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2多態(tài)性位點(diǎn)的選擇 根據(jù)GenBank單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi. nlm.nih.gov) Hap-map、GenBank提供的數(shù)據(jù)庫(kù)信息，凡亞裔人群中已報(bào)道的ERK5等位基因頻率gt;0.05的均可入選。最終我們選擇了-322G/T(rs3866958)作為我們的研究位點(diǎn)。

2.3TaqMan-MGB探針?lè)ɑ蚍中?ABI公司7500實(shí)時(shí)定量熒光PCR儀進(jìn)行檢測(cè)。-322G/T位點(diǎn)等位基因G對(duì)應(yīng)FAM 熒光基團(tuán)，T對(duì)應(yīng)VIC 熒光基團(tuán)。FAM 或VIC 熒光明顯上升代表檢測(cè)的樣本基因型為其對(duì)應(yīng)基因的純合子，而FAM和VIC熒光同步升則樣本為雜合基因型，見(jiàn)圖1。采用合成引物序列：上游引物5’-GAATGTGTCATCCCCGGTAG-3’,下游引物5’-CCTTTCCTTCCAGCTCACAG-3’ 。每次PCR擴(kuò)增均設(shè)立陰性對(duì)照(除未加入DNA模板外，其他加入試劑與待檢測(cè)標(biāo)本相同)。20 μL PCR 反應(yīng)體系包括:PCR Mix 0 μL,上、游引物及探針Mix 2 μL,DNA模板：1 μL，ROX 0.04 μL，3 d水 7 μL 。PCR反應(yīng)循環(huán)條件(ABI 7500實(shí)時(shí)熒光PCR儀)：95 ℃預(yù)變性10 min，使AmpliTaq Gold? DNA聚合酶活化，然后95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,55個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束由ABI 7500實(shí)時(shí)熒光PCR等位基因辨別系統(tǒng)對(duì)樣本進(jìn)行分型。分成GG、GT、TT型，結(jié)果由2位不知道病例或?qū)φ辗纸M情況的實(shí)驗(yàn)者判斷。在實(shí)驗(yàn)時(shí)設(shè)已知基因型的樣本為陽(yáng)性對(duì)照，并隨機(jī)抽取10%的樣本加以驗(yàn)證，結(jié)果100%吻合。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

在被納入本研究以前的時(shí)間里吸煙總量達(dá)100支者定義為“有”吸煙史，否則為“無(wú)”吸煙史。在入組本研究前每周至少飲酒1次、持續(xù)時(shí)間不少于1年者，定義為“有”飲酒史，反之定義為“無(wú)”飲酒史。采用基因計(jì)數(shù)法計(jì)算各多態(tài)等位基因頻率和基因型頻率。以擬合優(yōu)度2檢驗(yàn)進(jìn)行哈迪-溫伯格平衡(Hardy-weinberg equilibrium，HWE)檢驗(yàn)。病例組和對(duì)照組基本信息和基因型分布的比較采用2檢驗(yàn)。基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度采用校正優(yōu)勢(shì)比(adjusted odds ratio,adjusted,)及其95 %可信區(qū)間(95% confidence interval,CI)進(jìn)行描述。數(shù)據(jù)采用非條件Logistic回歸模型計(jì)算各基因型與結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。采用相乘模型來(lái)判斷基因-環(huán)境之間是否存在交互，同時(shí)采用似然比檢驗(yàn)來(lái)分析總的交互模型是否有意義。全部統(tǒng)計(jì)分析均在SPSS 9.13.0軟件中進(jìn)行。

Figure 1. The curves of genotypes detected by TaqMan-MGB fluorescence probe methods. A:fluorescent curves of GG genotype;B:fluorescent curves of GT genotype;C:fluorescent curves of TT genotype;D:auto allelic discriminaion by ABI7500 system.

結(jié) 果

1研究對(duì)象的一般情況

結(jié)直腸癌組與健康對(duì)照組比較，年齡、性別分布無(wú)差異,Pgt;0.05，吸煙、飲酒、癌癥家族史、體重指數(shù)分布有明顯差異,Plt;0.05，見(jiàn)表1。

2-322G/T與結(jié)直腸癌罹患風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系

-322 G/T多態(tài)性位點(diǎn)基因型在病例組與對(duì)照組頻數(shù)分布特征見(jiàn)表2。對(duì)照組基因型頻率符合哈迪-溫伯格平衡規(guī)律(Pgt;0.05)，通過(guò)對(duì)對(duì)照組與病例組各基因型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)各基因型分布無(wú)顯著差異(Pgt;0.05)，因此尚不能認(rèn)為ERK5基因-322G/T(rs3866958)多態(tài)性位點(diǎn)與結(jié)直腸癌發(fā)病存在關(guān)聯(lián)性。

3-322G/T位點(diǎn)各基因型在肥胖患者中的分布

我們進(jìn)一步按年齡、性別、吸煙、飲酒、癌癥家族史和體重指數(shù)分成亞組，在年齡、性別、吸煙、飲酒和癌癥家族史各亞組中，GG與GT+TT基因型分布無(wú)顯著差異(Pgt;0.05)。在以體重指數(shù)BMI進(jìn)行分層分析時(shí)，在BMI≥24 kg/m2的肥胖者中，病例組與對(duì)照組GG與GT+TT基因型分布差異顯著(Plt;0.01，OR=0.576 ,95%CI0.413-0.804 ) ，見(jiàn)表3。這說(shuō)明在肥胖者中，ERK5基因-322G/T(rs3866958)多態(tài)性與結(jié)直腸癌發(fā)病可能有關(guān)聯(lián)。

表1 CRC組與對(duì)照組多種混淆因素頻率比較

4-322G/T與BMI的交互作用

我們通過(guò)Logistic回歸模型以乘法效應(yīng)進(jìn)一步分層分析各基因型與性別、年齡、吸煙、飲酒、BMI、腫瘤家族史等環(huán)境暴露因素的交互作用，見(jiàn)表3，發(fā)現(xiàn)BMI與 -322 G/T位點(diǎn)基因型存在交互作用(Plt;0.01)。這提示BMI≥24 kg/m2與 -322 G/T位點(diǎn)多態(tài)性在促進(jìn)結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展上存在交互作用。

表2 ERK5-322G/T基因型頻數(shù)分布與散發(fā)性結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系

表3 以所選變量分層分析ERK5-322G/T基因型與散發(fā)性結(jié)直腸癌關(guān)系

討 論

結(jié)直腸癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)生發(fā)展機(jī)制尚未完全闡明，現(xiàn)一般認(rèn)為其發(fā)病是易感人群受環(huán)境的有害因素長(zhǎng)期作用的結(jié)果，此過(guò)程涉及到多步驟、多階段及多基因的改變[3, 4]。

MEK5-ERK5 是MAPK信號(hào)通路中最新的一條通路。細(xì)胞外的各種刺激因素-應(yīng)激、高滲透壓、生長(zhǎng)因子、絲裂原等可以激活MAPKKK(MEKK3或MEKK2) ,依次激活MAPKK(MEK5) , 然后激活ERK5[5],導(dǎo)致相應(yīng)蛋白表達(dá)的變化，從而引起細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化等生物效應(yīng)。1995年2個(gè)研究團(tuán)隊(duì)[6, 7]分離鑒定出了ERK5蛋白，并證實(shí)了MEK5與ERK5之間結(jié)合的高度特異性，MEK5是ERK5唯一的上游激酶，即使在MEK5過(guò)表達(dá)的情況下也不激活MAPK家族其它成員[6, 8]。小鼠ERK5基因由6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子組成，長(zhǎng)度5.6 kb，選擇性剪接內(nèi)含子1和/或2可產(chǎn)生3個(gè)亞型：a、b、c,ERK5b和ERK5c均沒(méi)有蛋白激酶活性，但可以通過(guò)MEF2C蛋白阻斷MEK5和ERK5介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)[9]。人類ERK5基因位于17P11.2,編碼816個(gè)氨基酸構(gòu)成的120 kD蛋白[10]。該蛋白有C端尾巴，長(zhǎng)度幾乎是其它MAPK家族成員的2倍，而它的獨(dú)特性也就在于它的C端尾巴。研究發(fā)現(xiàn)，C端尾巴有自主抑制功能，ERK5通過(guò)磷酸化C端尾巴，能自動(dòng)激活C端尾巴的活性[11]。MEK5-ERK5級(jí)聯(lián)的作用底物主要為MEF2C(myocyte enhancing factor-2C)[12]，MEF2A和MEF2D也是ERK5的下游作用靶點(diǎn)，但對(duì)MEF2B沒(méi)有作用。ERK5介導(dǎo)的MEF2A和MEF2D的磷酸化對(duì)EGF誘導(dǎo)的c-Jun基因表達(dá)起到非常重要的作用[13]。高濃度的PD98059、U0126和PD184352可以起到抑制ERK5 MAPK通路的作用。

現(xiàn)有研究證實(shí)，癌基因ras、cot、src等可以激活ERK5,從而影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖等效應(yīng)[14-16]。在腫瘤細(xì)胞中，ERK5的激活可導(dǎo)致一些蛋白激酶受體(如：ErbB家族)表達(dá)上調(diào)，而與腫瘤預(yù)后差、無(wú)病生存期短、腫瘤進(jìn)展及藥物耐受有關(guān)。Esparís-Ogando等[7]在對(duì)人類腫瘤細(xì)胞系中的ERK5進(jìn)行分析后，發(fā)現(xiàn)了呈持續(xù)激活狀態(tài)的ERK5與活化形式的ErbB2、ErbB3、ErbB4，而在人乳腺癌細(xì)胞中，ERK5信號(hào)通路可以通過(guò)ErbB依賴的機(jī)制傳遞加速生長(zhǎng)信號(hào)。Mehta等[18]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)MEK5-ERK5級(jí)聯(lián)與前列腺癌的骨轉(zhuǎn)移有關(guān)。Carvajal-Vergara等[19]發(fā)現(xiàn)在多發(fā)性骨髓瘤分離細(xì)胞中白細(xì)胞介素6(interleukin 6，IL-6)可以激活ERK5，ERK5的顯性負(fù)性形式可以限制骨髓瘤細(xì)胞的增殖，并使細(xì)胞對(duì)誘導(dǎo)凋亡的藥物敏感。Hayashi等[20]通過(guò)對(duì)黑色素瘤的腫瘤血管的發(fā)展進(jìn)行研究后，認(rèn)為VEGF及FGF介導(dǎo)的腫瘤血管形成均需要ERK5通路的參與。

本實(shí)驗(yàn)首次對(duì)ERK5 SNP與CRC的相關(guān)性進(jìn)行了研究，我們通過(guò)多中心、大樣本的病例對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)ERK5-322G/T(rs3866958)多態(tài)性位點(diǎn)與中國(guó)華南地區(qū)人群CRC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)明顯相關(guān)性。提示在普通人群中，ERK5 -322G/T單獨(dú)作用并不能增加CRC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。從表1可以看出，病例組與對(duì)照組在年齡、性別因素的分布上差異無(wú)顯著(Pgt;0.05)，而在吸煙、飲酒、癌癥家族史及BMI的分布上差異顯著(Plt;0.05)。這也印證了在普通人群中，吸煙、飲酒、癌癥家族史及肥胖是結(jié)直腸癌發(fā)病高危因素的結(jié)論。我們進(jìn)一步按年齡、性別、吸煙、飲酒、癌癥家族史和體重指數(shù)(BMI)等暴露因素進(jìn)行分層分析，發(fā)現(xiàn)在BMI≥24 kg/m2亞組中，GG與GT+TT基因型分布差異顯著(OR=0.576,95%CI0.413-0.804)，-322G/T與BMI≥24 kg/m2存在交互作用。說(shuō)明在肥胖患者中，-322G/T單獨(dú)作用可明顯降低其發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，與GG基因型相比，GT、TT基因型攜帶者的CRC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)下降42.4%，-322T是中國(guó)南方肥胖人群罹患結(jié)直腸癌的保護(hù)因素。其可能的解釋為-322T變異基因型影響了ERK5的正常功能，從而使其喪失了促進(jìn)Erb B等蛋白表達(dá)上調(diào)的能力，無(wú)法促進(jìn)腫瘤血管形成，失去對(duì)癌基因的應(yīng)答，而肥胖人群存在的胰島素抵抗加強(qiáng)了這些作用，所以該SNP位點(diǎn)可顯著降低肥胖人群的罹患風(fēng)險(xiǎn)。這也可能為我們?cè)诜逝秩巳?BMI≥24 kg/m2)中防治結(jié)直腸癌提供一個(gè)新的藥物作用靶點(diǎn)。在其它各亞組分層分析中，各基因型分布無(wú)明顯差異，也不存在交互作用，說(shuō)明在不同年齡段、吸煙、飲酒、家族史等特定人群中，-322G/T多態(tài)性并不能降低各亞組特定人群的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，這可能與吸煙、飲酒等有害因素及癌癥家族史背景使得該人群失去了-322G/T的保護(hù)作用。

綜上所述，ERK5 MAPK信號(hào)通路與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)，本試驗(yàn)研究的-322G/T(rs3866958)位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性單獨(dú)作用尚不能認(rèn)為可增加中國(guó)南方人群罹患結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)，但在BMI≥24 kg/m2的肥胖人群中，-322G/T單獨(dú)作用可明顯降低結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，可能為我們?cè)诜逝秩巳褐蟹乐蜟RC提供新的治療靶點(diǎn)，但具體作用機(jī)制及可能產(chǎn)生的效益需要更進(jìn)一步深入的研究。本研究由于樣本量不夠大且不是以人群為基礎(chǔ)的研究，可能存在研究對(duì)象的選擇偏倚。該位點(diǎn)為何可降低肥胖人群的患病風(fēng)險(xiǎn)，尚需進(jìn)一步的研究。但本實(shí)驗(yàn)畢竟是關(guān)于ERK5 SNP與結(jié)直腸癌關(guān)系的最早的實(shí)驗(yàn)之一，必將為后來(lái)研究者提供一定的參考與借鑒價(jià)值。

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AssociationbetweenERK5-322G/Tpolymorphismandgeneticsusceptibilitytosporadiccolorectalcancer

XIAN Zhen-yu, WANG Lei, REN Dong-lin, CHEN Dian-ke, DIAO De-chang, SONG Shun-xin, HUANG Qing-hua, WANG Jian-ping

(InstituteofGastroenterology,TheSixthAffiliatedHospital,SunYet-senUniversity,Guangzhou510655,China.E-mail:wangjpgz@yahoo.com.cn)

AIM: To investigate the correlation between extracellular signal-regulated kinase 5 (ERK5) -322G/T polymorphism (rs3866958) and the susceptibility to sporadic colorectal cancer (CRC) in southern Chinese population.METHODSERK5 -322G/T genotypes were determined by Taqman-MGB probes in 835 CRC cases and 908 healthy controls.RESULTSNo significance ofERK5 -322G/T genotype distribution between CRC patients and controls was observed, but -322G/T decreased the susceptibility to CRC in fat people whose BMI was ≥ 24 kg/m2. Compared to GG genotypes, the carriers with GT and TT genotypes had a significant decrease in the risk of CRC(OR=0.576,95%CI0.413-0.804,Plt;0.01).CONCLUSIONERK5 -322G/T polymorphism (rs3866958) has no significant relevance with sporadic CRC susceptibility, but decrease, the risk of CRC in people with fatness. The T variant genotype is an independent protective factor against sporadic CRC of overweight patients in southern Chinese population.

Colorectal neoplasms; Extracellular signal-regulated kinase 5; Polymorphism,single nucleotide

1000-4718(2011)04-0699-06

R735.3

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.04.015

2010-10-08

2011-02-16

△通訊作者 Tel:020-38785499;E-mail:wangjpgz@yahoo.com.cn