孟凡冰 陳 戀 鐘 耕,2 吳應(yīng)梅,3

(西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院1,重慶 400716)

(重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心2,重慶 400716)

(重慶三峽學(xué)院生物系3,重慶 404000)

蕨根淀粉的組分分離和純化研究

孟凡冰1陳 戀1鐘 耕1,2吳應(yīng)梅1,3

(西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院1,重慶 400716)

(重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心2,重慶 400716)

(重慶三峽學(xué)院生物系3,重慶 404000)

以蕨根淀粉為原料,采用有機(jī)溶劑低溫重結(jié)晶法和凝膠色譜分析對(duì)蕨根淀粉的分級(jí)和純化進(jìn)行了研究。結(jié)果表明:用正丁醇重結(jié)晶法重結(jié)晶 8次和 5次,可以得到高純度的蕨根直鏈和支鏈淀粉。蕨根直鏈淀粉和支鏈淀粉與碘絡(luò)合物的最大吸收波長(zhǎng)分別為 640 nm和 547 nm,直鏈淀粉和支鏈淀粉的藍(lán)值分別為0.91和 0.13,均處于相應(yīng)的分布范圍,表明純化后蕨根直鏈和支鏈淀粉的純度高。蕨根直鏈淀粉和支鏈淀粉的分子質(zhì)量范圍均小于玉米直鏈淀粉和支鏈淀粉。采用分光光度法測(cè)定蕨根淀粉含直鏈淀粉為 25.38%,高于玉米淀粉的 20.33%。

蕨根淀粉 分級(jí) 純化 研究

天然可再生的淀粉是一種混合物。它是由兩種不同糖苷鍵連接而成的淀粉組成,一種是直鏈淀粉,另一種是支鏈淀粉[1]。直鏈淀粉是一種相對(duì)分子質(zhì)量較小的鏈狀分子,而支鏈淀粉是一種相對(duì)分子質(zhì)量較大、高度分枝的大分子[2]。直鏈淀粉由于分子排列比較整齊,分子容易相互靠攏重新排列,所以在冷的水溶液中,直鏈淀粉有很強(qiáng)的凝聚沉淀性能。支鏈淀粉的分子大,各支鏈的空間阻礙作用使分子間的作用力減小,而且由于支鏈的作用,使水分子容易進(jìn)入支鏈淀粉的微晶束內(nèi),阻礙了支鏈淀粉分子的凝聚,使支鏈淀粉不易凝沉[3],工業(yè)上常利用這一特性將直鏈淀粉和支鏈淀粉分開(kāi)。淀粉的級(jí)分組成、分子結(jié)構(gòu)、相對(duì)分子質(zhì)量分布等對(duì)其凝膠特性、流變特性、熱特性和形貌有較大影響,從而影響到淀粉食品的深加工[4]。蕨根淀粉為天然的野生植物淀粉,研究證明蕨根淀粉制品具有強(qiáng)身健體、防癌抗癌之功效,開(kāi)發(fā)前景十分廣闊[5-6]。我國(guó)蕨根資源豐富,開(kāi)發(fā)利用蕨根淀粉資源,將其應(yīng)用于食品與保健食品中,具有重要的社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[7]。關(guān)于蕨根淀粉的分離純化、分子結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)以蕨根淀粉為原料,分離純化蕨根直鏈淀粉和支鏈淀粉,并預(yù)測(cè)其相對(duì)分子質(zhì)量范圍,為從分子水平了解蕨根淀粉的物化特性提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與化學(xué)試劑

蕨根 (Athyeium.breuifrons)淀粉,自制[6],經(jīng)測(cè)定淀粉純度為 98.7%,水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10.29%;玉米淀粉,華北制藥康欣有限公司。

Sepharose CL-2B:瑞典 Phar macia公司,其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器

FA2004A電子天平:上海精天電子儀器有限公司;TGL-16G型離心機(jī):上海安亭科學(xué)儀器廠;S53-54型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì):上海棱光技術(shù)有限公司;HH-4型恒溫水浴鍋:金壇市富華儀器有限公司;DZF-6020型真空干燥箱:上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司;漩渦混合器:上海青滬儀器廠;79-1磁力攪拌器:上海金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠;BS2-160自動(dòng)部分收集器:上海精科實(shí)業(yè)有限公司;210型酸度離子儀:北京哈納科儀科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 直鏈淀粉與支鏈淀粉的分離純化

1.3.1.1 直鏈淀粉與支鏈淀粉的粗分離

稱取 10.0 g淀粉,放入 500 mL燒杯中,加蒸餾水 50 mL使淀粉分散,再加 0.5 mol/L NaOH溶液300 mL。在沸水浴中加熱 20～30 min至整個(gè)淀粉糊完全透明,冷至室溫,離心 (4000 r/min,20 min)除去未分散的不溶性雜質(zhì) (沉淀部分)。以 2 mol/L HCL中和離心液至 pH為 6.5～7.5,再加 100 mL正丁醇-異戊醇 (3∶1)混合溶液,然后在沸水浴中加熱攪拌10 min至整個(gè)體系透明,冷卻至室溫。移入 2～4℃冰箱中靜置 24 h,離心 (6 000 r/min,20 min),沉淀物為粗直鏈淀粉,上清液即為粗支鏈淀粉[8-9]。分別收集備用。

1.3.1.2 直鏈淀粉的純化

將沉淀物即粗直鏈淀粉全部移入裝有 100 mL 90%的二甲基亞砜溶液中,再加入 200 mL飽和的正丁醇水溶液,然后在沸水浴中加熱攪拌至溶液分散透明,冷至室溫,在 2～4℃冰箱中保持 24 h,取出離心 (6 000 r/min,30 min),所得的沉淀物按上述步驟重復(fù)操作 8次 (即重結(jié)晶 8次),然后將沉淀物浸于無(wú)水乙醇中 24 h,再反復(fù)以無(wú)水乙醇洗滌沉淀,該沉淀物于室溫下真空干燥,得到純化的直鏈淀粉樣品,經(jīng)稱量為 1.4 g(干基,下同)。無(wú)水乙醇洗滌沉淀的目的是除去直鏈淀粉中所絡(luò)合的正丁醇。

1.3.1.3 支鏈淀粉的純化

將 1.3.1.1中的粗支鏈淀粉上清液置于分液漏斗中靜置,取下層液加 40 mL正丁醇 -異戊醇 (3∶1)混合液,在沸水浴中加熱攪拌至溶液分散透明,冷至室溫,移入 2～4℃冰箱中靜置 24 h,離心 (6 000 r/min,30 min)去除沉淀物,用上清液重復(fù)上述操作 5次 (即重結(jié)晶 5次)。上清液加入 2倍體積的無(wú)水乙醇沉淀,離心,將沉淀溶于熱的 200 mL 0.5 mol/L NaOH溶液中,離心去沉淀,中和。離心液中再加 2倍體積的無(wú)水乙醇,將沉淀溶于 200 mL蒸餾水中,用 2倍體積的無(wú)水乙醇再沉淀,以無(wú)水乙醇洗滌數(shù)次,室溫下真空干燥得到純化的支鏈淀粉樣品,經(jīng)稱量為 5.7 g。

1.3.2 凝膠過(guò)濾層析

1.3.2.1 淀粉樣品溶液的制備

分別稱取天然淀粉、直鏈淀粉和支鏈淀粉樣品 50 mg,用 1 mL無(wú)水乙醇濕潤(rùn),加入 2 mL 2 mol/L NaOH溶液和 5 mL蒸餾水,在沸水浴中加熱 20 min,使樣品完全溶解后,在 4℃的冰箱中放置 12 h。用1 mol/L的鹽酸中和至 pH 7.0左右,最后加蒸餾水將溶液定容至25 mL,此淀粉溶液的濃度為 2 mg/mL[10]。

1.3.2.2 層析條件

選用 Sepharose CL 2B層析柱 (Φ1.3×70 cm),取上述樣品溶液 1mL進(jìn)樣,以 0.05 mol/L NaCL(含0.02%疊氮鈉)溶液洗脫,洗脫速率 9 mL/h。用自動(dòng)部分收集器收集洗脫液,每管收集 3 mL,取 1 mL收集液用苯酚 -硫酸比色法 (1 mL 6%苯酚和 5 mL濃硫酸),在 490 nm測(cè)定吸光度[11]。

1.3.3 純化蕨根直鏈淀粉和支鏈淀粉碘復(fù)合物光譜掃描

準(zhǔn)確稱取 5 mg樣品,加 0.1 mL無(wú)水乙醇浸潤(rùn),再加 0.5 mL 2 mol/L NaOH,充分振蕩,室溫下放置12 h后,用 HC1將此溶液調(diào)至 pH 7.0左右,加水使其體積為 5 mL。此溶液的濃度為 1 mg/mL。取 1 mL淀粉溶液,加 35 mL蒸餾水,用 0.05 mol/L HC1調(diào)節(jié)至 pH 3.0,加入 0.5 mL碘試劑 (3.6 g碘化鉀于20 mL蒸餾水中,加 1.3 g碘,溶解后定容至 100 mL),定容至 50 mL,充分混勻后用 S53-54紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)于波長(zhǎng) 400～800 nm對(duì)樣品進(jìn)行吸收光譜掃描測(cè)定[12]。

1.3.4 藍(lán)值

稱取直鏈和支鏈淀粉各 1 mg,用 10 mL蒸餾水溶解,加入 2 mg碘和 20 mg碘化鉀,定容至 100 mL,在 680 nm處測(cè)定其吸光度。藍(lán)值是表示淀粉結(jié)合碘能力的另一個(gè)指標(biāo),通過(guò)測(cè)定所形成絡(luò)合物在一定波長(zhǎng)下的光吸收值,按下式計(jì)算而得[13]。

1.3.5 直鏈淀粉含量測(cè)定

1.3.5.1 標(biāo)注曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取 0.100 0 g自制的蕨根標(biāo)準(zhǔn)直鏈淀粉和支鏈淀粉,置于 100 mL燒杯中,用 1 mL無(wú)水乙醇濕潤(rùn),加入 1 mol/L氫氧化鈉溶液 9 mL,在沸水浴加熱至完全分散,迅速冷卻后定容至 100 mL;將直鏈淀粉和支鏈淀粉分散液及 0.09 mol/L氫氧化鈉溶液以一定比例混合;在混合溶液中加入乙酸溶液和碘試劑,顯色 10 min后,在 620 nm處測(cè)定其吸光度;以吸光度為縱坐標(biāo),直鏈淀粉含量為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得出回歸方程。

1.3.5.2 樣品測(cè)定

準(zhǔn)確稱取 0.100 0 g淀粉樣品,置于 100 mL燒杯中,用 1 mL無(wú)水乙醇濕潤(rùn),加入 1 mol/L氫氧化鈉溶液 9 mL,在沸水浴加熱至完全分散,迅速冷卻后定容至 100 mL;準(zhǔn)確吸取 2.5 mL淀粉分散液于 50 mL容量瓶中,加入 0.5 mL 1 mol/L乙酸溶液和 1 mL碘試劑,用漩渦混合器充分混合,加水定容至 100 mL,顯色 10 min后,在 620 nm處測(cè)定其吸光度[14]。

2 結(jié)果與討論

2.1 影響直鏈淀粉和支鏈淀粉分離及純度的主要因素

影響直鏈淀粉和支鏈淀粉分離及純度的主要因素包括用堿液分散淀粉時(shí)的攪拌速度、直鏈淀粉從鹽溶液中分離出來(lái)的速度、純化時(shí)正丁醇和水的用量、離心力的大小等。用堿液分散淀粉時(shí)的攪拌速度是影響分離效果的主要因素,如果攪拌劇烈,會(huì)使整個(gè)膠體結(jié)構(gòu)破壞,導(dǎo)致直鏈淀粉與支鏈淀粉無(wú)法完全分離,所以應(yīng)用小玻璃棒輕輕攪動(dòng)最好。直鏈淀粉在鹽溶液中容易老化,一旦老化,分離的直鏈淀粉即使加熱也極難溶解,在多次重結(jié)晶的過(guò)程中,增大水的用量使直鏈淀粉的濃度下降,可延緩直鏈淀粉的老化。離心力的大小和離心的溫度也是影響淀粉分離及純度的主要因素,當(dāng)離心速度不夠或離心溫度過(guò)高時(shí),離心液會(huì)出現(xiàn)混濁現(xiàn)象,直接影響到直鏈淀粉與支鏈淀粉的分離,因此,為了使直鏈淀粉和支鏈淀粉能夠較好的分離,離心速度必須大于 6 000 r/min,離心溫度最好控制在 2℃,離心時(shí)間最好大于20 min。

2.2 凝膠色譜分析

直鏈淀粉和支鏈淀粉不是單一的化合物,化學(xué)結(jié)構(gòu)不同,性質(zhì)也有差異。直鏈淀粉是葡萄糖通過(guò)α-D-1,4-糖苷鍵連接起來(lái)的直鏈狀高分子化合物,在溶液狀態(tài)下分子伸展,極性基團(tuán)暴露,空間障礙小,很容易與一些極性有機(jī)化合物如正丁醇、異戊醇等通過(guò)氫鍵締合,形成結(jié)晶性化合物而沉淀。而支鏈淀粉分子除有α-D-1,4-糖苷鍵外,還存在由α-D-1,6-糖苷鍵形成的分支結(jié)構(gòu),在溶液中呈分支狀,當(dāng)溶液中有極性有機(jī)化合物存在時(shí),由于有較大的空間位阻,不易形成復(fù)合物沉淀。因此,利用這種性質(zhì)可以對(duì)直鏈淀粉和支鏈淀粉進(jìn)行分離。

圖 1 蕨根淀粉凝膠色譜圖

圖 2 玉米淀粉凝膠色譜圖

直鏈淀粉和支鏈淀粉的分子結(jié)構(gòu)和相對(duì)分子質(zhì)量,其中直鏈淀粉的相對(duì)分子質(zhì)量小,一般在幾萬(wàn)到幾百萬(wàn)之間,支鏈淀粉的相對(duì)分子質(zhì)量大,一般在幾百萬(wàn)到幾億之間。當(dāng)?shù)矸廴芤和ㄟ^(guò)層析柱時(shí),分子直徑比凝膠孔大的支鏈淀粉分子不能滲透到凝膠孔內(nèi),只經(jīng)過(guò)凝膠顆粒之間的空隙,隨洗脫液一起移動(dòng),先流出柱外;而分子直徑比凝膠孔小的直鏈淀粉分子,能夠進(jìn)入凝膠相內(nèi),不能和洗脫液一樣向前移動(dòng),移動(dòng)的速度必然要落后于支鏈淀粉分子。因此,選用 Sepharose CL-2B(分級(jí)范圍為 1×105～2×107)對(duì)淀粉進(jìn)行凝膠色譜分析。蕨根淀粉和玉米淀粉的凝膠過(guò)濾色譜見(jiàn)圖 1和 2。由圖可知,蕨根淀粉和玉米淀粉主要有兩個(gè)級(jí)分,分別為支鏈淀粉和直鏈淀粉,其中支鏈淀粉的平均聚合度較直鏈淀粉大的多。

圖 3 蕨根支鏈淀粉和玉米支鏈淀粉凝膠色譜圖

分離純化的蕨根支鏈淀粉和玉米支鏈淀粉 (重結(jié)晶 5次)凝膠色譜見(jiàn)圖 3。由圖 3可知,蕨根支鏈淀粉和玉米支鏈淀粉的出峰位置都靠近外水體積,在洗脫體積為 10～50 mL之間出現(xiàn)單一的吸收峰,但蕨根支鏈淀粉的出峰時(shí)間要晚于玉米支鏈淀粉,說(shuō)明蕨根支鏈淀粉相對(duì)分子質(zhì)量要小于玉米支鏈淀粉,而玉米支鏈淀粉的相對(duì)分子質(zhì)量范圍為 107～109,就是說(shuō),蕨根支鏈淀粉的相對(duì)分子質(zhì)量應(yīng)小于107～109。在 50 mL以后蕨根支鏈淀粉和玉米支鏈淀粉均無(wú)吸收峰出現(xiàn),說(shuō)明經(jīng)過(guò) 5次重結(jié)晶得到的蕨根支鏈淀粉純度已經(jīng)非常高了。

圖 4 蕨根直鏈淀粉和玉米直鏈淀粉凝膠色譜圖

分離純化的蕨根直鏈淀粉和玉米直鏈淀粉 (重結(jié)晶八次)凝膠色譜見(jiàn)圖 4。由圖 4可知,蕨根直鏈淀粉和玉米直鏈淀粉在外水體積處均無(wú)吸收峰出現(xiàn),在洗脫體積為 30～70 mL之間出現(xiàn)單一的吸收峰。蕨根直鏈淀粉的出峰時(shí)間要晚于玉米直鏈淀粉,說(shuō)明蕨根直鏈淀粉相對(duì)分子質(zhì)量要小于玉米直鏈淀粉。經(jīng)過(guò) 8次重結(jié)晶可以得到完全純化的蕨根直鏈淀粉。

2.3 純化蕨根直鏈淀粉和支鏈淀粉碘復(fù)合物吸收光譜

淀粉 -碘復(fù)合物的顏色由兩種因素決定:一是連續(xù)的螺旋直鏈淀粉片段的平均長(zhǎng)度;二是淀粉的結(jié)晶程度。直鏈淀粉在水溶液中并不是線型分子,而是由分子內(nèi)氫鍵作用使鏈卷曲成螺旋狀,每個(gè)環(huán)轉(zhuǎn)含有 6個(gè)葡萄糖殘基。當(dāng)直鏈淀粉遇碘時(shí),每個(gè)螺旋吸附 1個(gè)碘分子,碘分子位于螺旋中央,借助范德華力聯(lián)系在一起,形成深藍(lán)色絡(luò)合物。支鏈淀粉與碘根據(jù)其分支和聚合度的不同而生成紫紅 -棕紅色,淀粉 -碘絡(luò)合物吸收峰也隨之發(fā)生變化。利用淀粉結(jié)合碘后所呈現(xiàn)的顏色差異,可以判斷所分離淀粉的純度。直鏈淀粉與碘生成藍(lán)色,吸收峰在 600～650 nm;支鏈與碘生成紫紅色,吸收峰為 530～590 nm。蕨根直鏈淀粉和支鏈淀粉碘復(fù)合物在 400～800 nm范圍內(nèi)的紫外可見(jiàn)光吸收?qǐng)D譜見(jiàn)圖 5。從圖 5可以看出蕨根直鏈淀粉的最大吸收波長(zhǎng)為 640 nm,支鏈淀粉與碘絡(luò)合物的最大吸收波長(zhǎng)為 547 nm,均在相應(yīng)的分布范圍內(nèi),表明純化后的蕨根直鏈淀粉和支鏈淀粉的純度較高。

圖 5 淀粉碘復(fù)合物吸收光譜

2.4 藍(lán)值

直鏈淀粉和支鏈淀粉由于它們分子結(jié)構(gòu)和線性聚合度有的差異,所以其藍(lán)值也不同,直鏈淀粉由于其線性聚合度很高,故藍(lán)值很大,一般為 0.8～1.2,支鏈淀粉的側(cè)鏈鏈長(zhǎng)只有 14～30葡萄糖殘基,則藍(lán)值在 0.08～0.22之間。試驗(yàn)測(cè)得蕨根直鏈淀粉和支鏈淀粉的藍(lán)值為分別為 0.91和 0.14,均處于相應(yīng)的分布范圍內(nèi),表明純化后的蕨根直鏈淀粉和支鏈淀粉的純度較高。

2.5 直鏈淀粉含量測(cè)定

用自制蕨根直鏈淀粉和玉米直鏈淀粉純品作標(biāo)準(zhǔn)品,測(cè)定不同直鏈淀粉含量溶液的吸光度,得出標(biāo)準(zhǔn)直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線,見(jiàn)圖 6和圖 7。

從直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線看到,直鏈淀粉的含量與620 nm處的吸光度呈顯著的線性正相關(guān)。

在 620 nm處測(cè)定淀粉樣液的吸光度并計(jì)算其直鏈淀粉含量,結(jié)果見(jiàn)表 1。如表 1所示,蕨根淀粉的直鏈淀粉含量高于玉米淀粉,為 25.38%。

表 1 蕨根淀粉和玉米淀粉吸光度及直鏈淀粉含量

3 結(jié)論

3.1 堿液分散淀粉時(shí)的攪拌速度、直鏈淀粉從鹽溶液中分離出來(lái)的速度、純化時(shí)正丁醇和水的用量、離心速度和離心時(shí)的溫度對(duì)直鏈淀粉和支鏈淀粉的分離及純度有影響。

3.2 用正丁醇重結(jié)晶法重結(jié)晶 8次和 5次可以得到純度較高的蕨根直鏈淀粉和支鏈淀粉。凝膠過(guò)濾層析表明:蕨根直鏈淀粉和支鏈淀粉的相對(duì)分子質(zhì)量均小于玉米直鏈淀粉和支鏈淀粉。

3.3 從純化蕨根直鏈淀粉和支鏈淀粉碘復(fù)合物吸收光譜看出,蕨根直鏈淀粉與碘絡(luò)合物的最大吸收波長(zhǎng)為 640 nm,支鏈淀粉與碘絡(luò)合物的最大吸收波長(zhǎng)為 547 nm,均在相應(yīng)的分布范圍內(nèi)。

3.4 蕨根直鏈淀粉和支鏈淀粉的藍(lán)值分別為 0.91和 0.13,均處于相應(yīng)的分布范圍內(nèi),表明純化后的蕨根直鏈淀粉和支鏈淀粉的純度較高。

3.5 蕨根淀粉和玉米淀粉的直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 25.38%和 20.33%,蕨根淀粉的直鏈淀粉含量較玉米淀粉高。

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Fractionation and Purification of Fern Root Starch

Meng Fanbing1Chen Lian1Zhong Geng1,2Wu Yingmei1,3
(College of Food Science,Chongqing1400716)
(Engineering Technique Research Center of Chongqing for Special Food2,Chongqing 400716)
(BiologyDepartment,Chongqing Three gorgesUniversity3,Chongqing 404000)

Fern root starch was fractionated and purified by the methods of organic solvent,low temperature re2 crystallization and gel permeation.Results:Pure fern root amylose and amylopectin can be obtained,respectively after 8 times and 5 times recrystallization with n-butyl alcohol solvent.The adsorption wavelengthsλmaxof the amyloseiodine complex and the amylopectin-iodine are 640 nm and 547 nm,respectively,and their blue values are 0.91 and 0.13,respectively,all in corresponding range.It indicates that the fern root amylose and amylopectin obtained are of high-purity.The amylose contents of fern root starch and cornstarch are 25.38%and 20.33%,separately.

fern root starch,fractionation,purification,study

TS236.9

A

1003-0174(2011)01-0056-05

重慶市科技攻關(guān)項(xiàng)目(CSTC,2009AC5183)

2009-12-30

孟凡冰,女,1986年出生,碩士,現(xiàn)代食品加工理論與技術(shù)

鐘耕,男,1964年出生,教授,博士生導(dǎo)師,糧油食品加工、碳水化合物理論與應(yīng)用研究