丁春明 喻 鋼 朱寶華

胃癌的發(fā)生和發(fā)展涉及許多腫瘤抑制基因和腫瘤相關(guān)基因，其中較為引人注目的是p53和c-erbB-2。大量研究表明，p53和c-erbB-2與胃癌的生物學(xué)行為密切相關(guān)，但對其在胃癌發(fā)展過程中的作用則尚未完全明了。浸潤性生長是胃癌最具特征性的生物學(xué)行為之一，我們采用免疫組化方法，對早期和進(jìn)展期的胃癌手術(shù)切除標(biāo)本進(jìn)行研究，初步探討p53和c-erbB-2的陽性表達(dá)與胃癌進(jìn)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

收集姜堰市人民醫(yī)院普外科2005年5月～2008年5月、手術(shù)切除的胃癌病例139例，均經(jīng)病理檢查證實(shí)，包括早期胃癌54例，進(jìn)展期胃癌85例。其中男性78例，女性61例，年齡38～77歲。所有病例術(shù)前未接受放療、化療。

1.2 主要試劑

p53和c-erbB-2鼠抗人單克隆抗體均購自Santa Cruz公司，免疫組化S-P試劑盒和DAB顯色試劑盒均購自北京中山生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

標(biāo)本常規(guī)福爾馬林液固定，石蠟包埋切片，分別行HE和免疫組化染色。采用免疫組化S-P試劑盒檢測，操作按說明書進(jìn)行。石蠟切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，雙蒸水沖洗3次×5 min;每張切片滴加3%H2O250 μl，37℃、10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性;雙蒸水沖洗 3次 ×5 min;抗原修復(fù)，將盛有0.01 mol/L的枸櫞酸鈉緩沖液(pH 6.0)的容器，放入微波爐內(nèi)高火加熱2 min后取出(溫度保持在92℃ ～98℃)，將切片置入，放回微波爐，低火維持10 min，將容器取出，自然冷卻至室溫(約40 min);取出切片，PBS浸泡2次×3 min;每張切片滴加50 μl 10%正常山羊血清封閉，室溫下放置10 min，甩去;每張切片滴加50 μl一抗工作液(鼠抗人p53、c-erbB-2單克隆抗體)，4℃過夜;PBS沖洗3次×2 min;每張切片滴加二抗50 μl(生物素化羊抗鼠 IgG 1∶100)，37℃孵育30 min;PBS沖洗3次×2 min;每張切片滴加辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素50 μl，37℃孵育15 min;PBS沖洗5次×4 min;每張切片滴加新鮮配制的DAB顯色劑50 μl，鏡下觀察2～5 min;自來水充分沖洗;蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，雙蒸水沖洗，梯度酒精脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片。用已知陽性切片作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照，光鏡下觀察。

1.4 結(jié)果判定

p53、c-erbB-2均以細(xì)胞核或細(xì)胞核伴有胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，只有胞質(zhì)陽性視為非特異染色［1］。高倍鏡下分別計數(shù)至少500個腫瘤細(xì)胞，以陽性細(xì)胞數(shù)＞10%作為c-erbB-2或p53陽性標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料應(yīng)用頻數(shù)或率表示，率的比較采用Pearson χ2檢驗，頻數(shù)的比較采用秩和檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 早期胃癌和進(jìn)展期胃癌中p53陽性表達(dá)率比較(表1)

表1 早期胃癌和進(jìn)展期胃癌中p53陽性表達(dá)率比較(例)

由表1可見，進(jìn)展期胃癌p53陽性表達(dá)率較早期胃癌高，兩者比較有統(tǒng)計學(xué)意義，χ2=6.667，P=0.010＜0.05。

2.2 早期胃癌和進(jìn)展期胃癌中c-erbB-2陽性表達(dá)率比較(表2)

進(jìn)展期胃癌c-erbB-2陽性表達(dá)率高于早期胃癌，χ2=31.715，P=0.000 ＜0.01，兩者比較有統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

表2 早期胃癌和進(jìn)展期胃癌中c-erbB-2陽性表達(dá)率比較(例)

2.3 c-erbB-2與p53表達(dá)的相關(guān)性分析(表3)

表3 c-erbB-2與p53表達(dá)的相關(guān)性(例)

2.4 p53和c-erbB-2陽性表達(dá)與胃癌進(jìn)展的關(guān)系(表4)

表4 p53和c-erbB-2陽性表達(dá)與胃癌進(jìn)展的關(guān)系(例)

由表4可見，無論p53是否陽性表達(dá)，進(jìn)展期胃癌c-erbB-2陽性表達(dá)率均顯著高于早期胃癌(p53表達(dá)陽性組，χ2=8.391，P=0.004 ＜ 0.01;p53 表達(dá)陰性組，χ2=21.474，P=0.000 ＜0.01)。分層危險度估計結(jié)果:p53表達(dá)陽性組OR=5.271＞1，95%可信區(qū)間為1.622～17.126;p53 表達(dá)陰性組 OR=16.762 ＞1，95%可信區(qū)間為 4.302～65.306，說明 c-erbB-2陽性表達(dá)是胃癌發(fā)展的1個危險因素。OR值一致性檢驗結(jié)果:χ2=1.614，P=0.204 ＞0.05，說明 p53 表達(dá)陽性和陰性的OR值比較無統(tǒng)計學(xué)意義。協(xié)變量分析結(jié)果:χ2=26.554，P=0.000 ＜0.01，說明在剔除 p53 的影響后，c-erbB-2陽性表達(dá)與胃癌進(jìn)展仍顯著相關(guān)。公共OR值估計結(jié)果:公共OR值=8.962＞1，95%可信區(qū)間為3.747 ～21.435。

3 討論

3.1 p53基因和c-erbB-2基因

p53基因是抑癌基因，位于人類17號染色體短臂17p13.1［2］，編碼分子量為 53 kD 的磷酸化蛋白，可分為野生型和突變型。野生型p53具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及凋亡雙重作用。它能維持細(xì)胞的正常生長，當(dāng)細(xì)胞遭受損害，野生型p53就誘導(dǎo)DNA受損的細(xì)胞進(jìn)入G1/G0靜止期，抑制細(xì)胞增殖，直至損傷的DNA修復(fù)，若修復(fù)失敗則誘導(dǎo)損傷的細(xì)胞凋亡。正常情況下，p53蛋白的半衰期甚短，而且極不穩(wěn)定，采用常規(guī)免疫組化方法很難測出。當(dāng)p53基因缺失、突變導(dǎo)致表達(dá)異常時稱為突變型p53，它失去上述細(xì)胞調(diào)節(jié)功能，并且穩(wěn)定性增加，半衰期延長，在細(xì)胞中堆積，從而引起細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和癌變。如果采用免疫組化方法，檢側(cè)出p53蛋白間接表明該基因已突變失活［3］。本研究中，我們將染色細(xì)胞數(shù)＞10%作為判定p53蛋白過表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)［4］，即表達(dá)陽性。

c-erbB-2基因(又稱HER2/neu)是癌基因，定位于人類染色體17q21，編碼產(chǎn)物為185 kD的糖蛋白［5］，即 c-erbB-2 蛋白(ERBB2)。ERBB2 主要在胚胎發(fā)育時開始表達(dá)，成年后正常組織可檢測到少量［6］。它和表皮生長因子受體(EGFR)具有高度同源性，同屬于受體酪氨酸激酶(RTK)Ⅰ家族，該家族包括ERBB1(EGFR)、ERBB2、ERBB3和 ERBB4。在生理條件下，ERBB2是與其他RTKⅠ受體形成異二聚體而被激活，參與細(xì)胞關(guān)鍵功能的調(diào)控，涉及細(xì)胞生存、增殖、凋亡、遷移和分化。當(dāng)某些因素導(dǎo)致ERBB2過表達(dá)時，將導(dǎo)致異常的ERBB2同型二聚體形成以及通過包含ERBB2的異二聚體增強(qiáng)信號傳遞，導(dǎo)致RTKⅠ調(diào)控網(wǎng)絡(luò)瓦解，并具有腫瘤轉(zhuǎn)化活性［7］。本研究中，我們采用免疫組化方法檢測c-erbB-2蛋白，并將染色細(xì)胞數(shù)＞10%作為判定c-erbB-2蛋白過表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)［8］。

3.2 p53和c-erbB-2的表達(dá)及其相關(guān)性

我們采用免疫組化的方法對139例胃癌標(biāo)本進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示p53陽性率為48.9%，略低于既往文獻(xiàn)報道的50% ～55%［2］;而文獻(xiàn)報道的c-erbB-2的陽性率則很不一致，我們的結(jié)果為44.6%。在不同發(fā)展程度的胃癌中，p53和c-erbB-2陽性率并不相同，隨著胃癌的進(jìn)展，p53和c-erbB-2陽性率都顯示出上升的趨勢(P ＜0.05，P ＜0.01)，說明抑癌基因 p53的突變和癌基因c-erbB-2的激活隨著胃癌的發(fā)展均顯著增加。我們比較了p53陽性組和p53陰性組的c-erbB-2陽性表達(dá)率，結(jié)果顯示c-erbB-2陽性表達(dá)率在p53陽性組為54.4%，在p53陰性組則為35.2%，兩者比較存在顯著差異。p53陽性組c-erbB-2表達(dá)陽性率明顯高于p53陰性組，說明c-erbB-2和p53的表達(dá)具有某種相關(guān)性。我們推測，抑癌基因p53突變之后喪失了對異?；虮磉_(dá)的抑制和修復(fù)作用，使癌基因c-erbB-2的異常表達(dá)較p53未突變時相對容易。

3.3 p53和c-erbB-2表達(dá)與胃癌進(jìn)展的關(guān)系

為了進(jìn)一步研究p53和c-erbB-2分別與胃癌進(jìn)展的關(guān)系，我們以p53為分層變量，對p53和c-erbB-2進(jìn)行分析。結(jié)果顯示:分層危險度估計，p53表達(dá)陽性組和p53表達(dá)陰性組OR值均＞1，說明c-erbB-2陽性表達(dá)是胃癌發(fā)展的1個危險因素;OR值一致性檢驗，p53表達(dá)陽性和陰性的OR值比較無統(tǒng)計學(xué)意義，說明p53是否陽性表達(dá)對胃癌進(jìn)展無明顯影響;協(xié)變量分析，在剔除p53的影響后，c-erbB-2陽性表達(dá)與胃癌進(jìn)展仍顯著相關(guān)。我們推測，在胃癌的發(fā)展過程中，由于突變的p53失去了抑癌功能，不能修復(fù)損傷的DNA，有利于其他突變的基因發(fā)揮作用，而這些基因才真正賦予了胃癌惡性生物學(xué)行為，例如c-erbB-2。

總而言之，胃癌的發(fā)病是1個多基因多步驟的過程，在這個過程中既有抑癌基因的突變，也有癌基因的激活。抑癌基因p53突變有利于癌基因c-erbB-2的表達(dá);c-erbB-2陽性表達(dá)是胃癌發(fā)展的1個危險因素，與胃癌的浸潤發(fā)展密切相關(guān)。

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