薛英杰 孟令新 王郡甫

HIF-1α是1種轉(zhuǎn)錄蛋白通過(guò)調(diào)節(jié)新陳代謝和誘導(dǎo)血管形成在腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移方面起重要作用。HIF-1α在人類、動(dòng)物幾乎所有組織器官中均有表達(dá)。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子-C(VEGF-C)是1種重要的淋巴管生成因子，研究發(fā)現(xiàn)其在多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)，與腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。關(guān)于HIF-1α、VEGF-C在賁門癌組織中的表達(dá)尚未見報(bào)道，我們旨在研究HIF-1α、VEGF-C在賁門癌中的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集日照市人民醫(yī)院病理科2002年6月～2009年6月間具有完整臨床病理資料的賁門癌組織標(biāo)本共60例。術(shù)后均經(jīng)病理檢查確診，其中男性34例，女性26例，年齡36～74歲，平均(52.24±10.32)歲。腫瘤直徑≥5 cm 35例，＜5 cm 25例;高分化20例，中分化35例，低分化5例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者39例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者21例;腫瘤浸潤(rùn)深度≥1/2肌層者38例，＜1/2肌層者22例。Ⅰ～Ⅱ期24例，Ⅲ期25例，Ⅳ期11例?；颊咝g(shù)前均未作過(guò)任何放療或化療等治療。正常賁門標(biāo)本取自因食管、胃囊病變行賁門切除術(shù)的患者，共20例，男性11例，女性9例，年齡31～68歲，平均(46.67 ±9.63)歲。

1.2 染色方法

所有組織標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋，制成4 μm厚連續(xù)切片，按說(shuō)明書步驟行HE、免疫組化SABC染色。HIF-1α抗體稀釋倍數(shù)為1∶100，PBS代替一抗作陰性對(duì)照，已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照。小鼠抗人 HIF-1α單克隆抗體、即用型兔抗人VEGF-C多克隆抗體、SABC免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。著色強(qiáng)度按染色深度分:陰性(－)、弱陽(yáng)性(+)、中度陽(yáng)性(++)、強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。40×10倍視野下隨機(jī)選5個(gè)視野，計(jì)數(shù)著色強(qiáng)度和著色百分比，利用公式計(jì)算著色指數(shù)，著色指數(shù)=陽(yáng)性百分?jǐn)?shù)×著色強(qiáng)度+1［1］，將其作為統(tǒng)計(jì)分析綜合指標(biāo)。

1.3 熒光定量RT-PCR

Trizol(Invitriogen公司)提取標(biāo)本總RNA，引物序列由Oligo6.0軟件設(shè)計(jì)、北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。取2 μg總RNA用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega公司)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。各種PCR引物及退火溫度見表1，反應(yīng)條件為95℃ 2 min;95℃ 30 sec;目的基因最佳退火溫度30 sec;72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán);72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物在含溴化乙錠2%的瓊脂糖凝膠中電泳(電壓5 V/cm)，用凝膠成像分析系統(tǒng)檢測(cè)條帶積分吸光度值。擴(kuò)增曲線數(shù)據(jù)分析選擇GeneAmp 5700 Sequence Detection System(Applied Biosystems，USA)中second derivative maximum(最大二階導(dǎo)數(shù))模式，基線調(diào)整選擇算術(shù)模式得到Threshold cycle(Ct值)，即熒光信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)在real-time Q-PCR整個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)中進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)和連續(xù)分析擴(kuò)增相關(guān)熒光信號(hào)，得到相應(yīng)Ct值。以目的基因與內(nèi)參照(β-actin)積分吸光度比值衡量目的基因mRNA表達(dá)水平。因Ct值和起始拷貝數(shù)有著對(duì)應(yīng)關(guān)系，同一標(biāo)本中不同目的基因與βactin基 因 初 始 模 板 量 比 值 為 2-△Ct=2-［Ct(目的基因)－Ct(β-actin)］?！鰿t=Ct(目的基因)－ Ct(β-actin)。比較同一基因在賁門癌和正常賁門組織中表達(dá)增加或減少倍 數(shù) = 癌 組 織 ［2-Ct(目的基因)-Ct(β-actin)］/正 常 組 織［2-Ct(目的基因)-Ct(β-actin)］。

表1 RT-PCR反應(yīng)中各基因的引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 HIF－1α、VEGF－C 在賁門組織中的表達(dá)

HIF－1α陽(yáng)性物質(zhì)主要定位于賁門癌細(xì)胞的胞核、胞質(zhì)中，呈棕黃色顆粒狀，間質(zhì)細(xì)胞未見著色表達(dá);在正常賁門黏膜細(xì)胞中只有基底層少數(shù)細(xì)胞呈弱陽(yáng)性表達(dá)。而VEGF－C主要定位于癌細(xì)胞的胞質(zhì)，在正常賁門黏膜組織中個(gè)別細(xì)胞表達(dá)或無(wú)表達(dá)。HIF－1α、VEGF－C在賁門癌組織中的表達(dá)明顯高于正常賁門組織(均 P ＜0.05)，見表2。

表2 不同賁門黏膜組織中HIF-1α、VEGF-C的表達(dá)情況(s)

表2 不同賁門黏膜組織中HIF-1α、VEGF-C的表達(dá)情況(s)

注:▲為兩組比較，P ＜0.01

VEGF-C正常賁門黏膜組別 例數(shù) HIF-1α 20 1.000 ±0.000 1.000 ±0.000賁門癌 60 2.342±0.233▲ 2.051±0.538▲

2.2 HIF-1α、VEGF-C與賁門癌臨床病理學(xué)特征關(guān)系

隨著癌細(xì)胞分化程度降低和TNM分期增加，HIF-1α、VEGF-C表達(dá)水平增加，且高分化、中分化與低分化組相比均有顯著性差異(P＜0.01)，Ⅰ～Ⅱ期與Ⅲ～Ⅳ期相比也有顯著差異(P＜0.05);有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組HIF-1α、VEGF-C表達(dá)水平明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P＜0.01)，且靠近轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的癌細(xì)胞HIF-1α、VEGF-C陽(yáng)性程度高于遠(yuǎn)離淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織的癌細(xì)胞。隨著浸潤(rùn)深度增加，HIF-1α、VEGF-C表達(dá)水平也逐漸增加，≥1/2肌層浸潤(rùn)組HIF-1α、VEGF-C表達(dá)水平比＜1/2組明顯增加(P ＜0.01)。HIF-1α、VEGF-C 表達(dá)水平均與患者年齡、性別、腫瘤大小無(wú)關(guān)(P＞0.05)。見表3。

表3 HIF-1α、VEGF-C與賁門癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系(s)

表3 HIF-1α、VEGF-C與賁門癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系(s)

注:▲為 P ＜0.01，★為 P ＜0.05

VEGF-C年齡(歲)臨床病理特征 例數(shù) HIF-1α＜50 38 2.218 ±0.273 1.924 ±0.583≥50 22 2.525 ±0.231 2.243 ±0.677性別男34 2.286 ±0.225 2.002 ±0.482女26 2.481 ±0.217 2.258 ±0.547腫瘤大小(cm)＜5 25 2.304 ±0.188 1.985 ±0.731≥5 35 2.492 ±0.236 2.204 ±0.655組織學(xué)分級(jí)高分化 20 1.453 ±0.237 1.423 ±0.634中分化 35 2.392 ±0.563▲ 1.984 ±0.462★低分化 5 3.725 ±0.564▲ 2.712 ±0.745▲肌層浸潤(rùn)深度＜1/2 22 1.624 ±0.203 1.667 ±0.752≥1/2 38 3.541 ±0.548▲ 2.423 ±0.641▲淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)39 1.382 ±0.563 1.698 ±0.326有21 3.628 ±0.612▲ 2.421 ±0.778▲TNM分期Ⅰ ～Ⅱ期 24 2.164 ±0.232 1.685 ±0.640Ⅲ ～Ⅳ期 36 3.236±0.683★ 2.231±0.723★

2.3 HIF-1α、VEGF-C在賁門癌組織中表達(dá)的相關(guān)性分析

隨著賁門癌組織細(xì)胞分化程度的降低，HIF-1α、VEGF-C表達(dá)均呈遞增趨勢(shì)，經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)分析示HIF-1α與 VEGF-C呈正相關(guān)(γ=0.487，P＜0.01)。與無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組相比，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中HIF-1α與VEGF-C的表達(dá)明顯增加，經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)分析示HIF-1α與VEGF-C呈正相關(guān)(γ=0.826，P＜0.01)。

2.4 熒光定量RT-PCR結(jié)果

RT-PCR反應(yīng)完成后，HIF-1α、VEGF-C和 β-actin反應(yīng)產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)目的擴(kuò)增產(chǎn)物。電泳凝膠在Kodak440凝膠成像系統(tǒng)上成像，結(jié)果顯示擴(kuò)增產(chǎn)物單一、無(wú)雜帶，為目的DNA片段，產(chǎn)物大小分別為:HIF-1α:168 bp，VEGF-C:142 bp，β-actin:305 bp。其中β-actin mRNA在不同組織中表達(dá)量大致相等，亮度大致相當(dāng)，而癌組織中VEGF-C mRNA、HIF-1α mRNA條帶較正常組織亮，說(shuō)明VEGF-C mRNA、HIF-1α mRNA在癌組織中的表達(dá)較正常賁門組織中表達(dá)高。熒光定量RT-PCR反應(yīng)完成后，得到HIF-1α、VEGF-C和內(nèi)參β-actin RT-PCR反應(yīng)過(guò)程的熒光-PCR循環(huán)數(shù)變化曲線。GeneAmp 5700 Sequence Detection System熒光－溫度變化融解曲線分析結(jié)果表明，各管融解曲線為單峰，即RT-PCR產(chǎn)物為單一擴(kuò)增產(chǎn)物。HIF-1α、VEGF-C mRNA在賁門癌組織中的表達(dá)明顯高于正常組織，分別增加3.76和2.14倍。在Rn=0.01水平，熒光定量RT-PCR檢測(cè)各目的基因與內(nèi)參的結(jié)果及數(shù)據(jù)處理，見表4。

表4 賁門癌及正常組織細(xì)胞中各基因表達(dá)情況的比較

2.5 Real-time PCR產(chǎn)物基因測(cè)序結(jié)果

應(yīng)用3700基因測(cè)序儀行PCR產(chǎn)物基因測(cè)序，應(yīng)用NCBI Blast 2.2.16:Nucleotide sequence(BLAST Basic Local Alignment Search Tool)進(jìn)行基因比對(duì)，發(fā)現(xiàn)HIF-1α序列與Genbank提供的定位于14q21-q24已知序列(BC043769)完全一致。VEGF-C基因序列與Genbank提供的定位于4q34.3已知序列(ID:7424)完全一致，說(shuō)明檢測(cè)結(jié)果是真實(shí)可靠的。

3 討論

賁門癌發(fā)生在胃賁門部，是常見的胃腸道惡性腫瘤之一，具有獨(dú)特的組織解剖學(xué)特性和臨床表現(xiàn)，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是賁門癌重要的生物學(xué)特征，也是難以徹底根治的主要因素，臨床以淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為主，且發(fā)生較早，死亡率約占總死亡率的12%。在決定賁門癌預(yù)后的眾多因素中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是其中重要的1個(gè)因素。

HIF-1是由HIF-1α和 HIF-1β 2個(gè)亞基組成的異源二聚體蛋白，其中HIF-1α主要控制HIF-1蛋白的穩(wěn)定和轉(zhuǎn)活。HIF-1α是1992年作為被低氧誘導(dǎo)的、連接在紅細(xì)胞生成素基因缺氧反應(yīng)元件上的轉(zhuǎn)錄因子而被發(fā)現(xiàn)的。在實(shí)質(zhì)腫瘤生長(zhǎng)所造成的低氧微環(huán)境中，HIF-1α通過(guò)調(diào)控一系列有關(guān)基因的表達(dá)來(lái)介導(dǎo)組織細(xì)胞對(duì)缺氧的適應(yīng)反應(yīng)，從而在維持腫瘤細(xì)胞的能量代謝、新生血管生成、促進(jìn)增殖轉(zhuǎn)移以及放化療耐受等過(guò)程中起重要作用。HIF-lα作為缺氧條件下細(xì)胞應(yīng)答最基本的調(diào)控因子，與腫瘤的發(fā)生、預(yù)后及治療反應(yīng)存在密切相關(guān)性［2］。HIF-1α在腫瘤中的過(guò)度表達(dá)與血管濃度、腫瘤浸潤(rùn)及預(yù)后相關(guān)。Griffiths等研究發(fā)現(xiàn)胃癌浸潤(rùn)邊緣 HIF-1α的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)［3］。多因素分析顯示HIF-1α是食管癌獨(dú)立的預(yù)后因素，HIF-1α高表達(dá)者生存期較短，HIF-1表達(dá)與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、DFS、總生存期密切相關(guān)［4，5］。本研究發(fā)現(xiàn)，60例賁門癌組織中存在不同程度的HIF-1α表達(dá)，其著色指數(shù)明顯高于正常賁門組織，提示HIF-1α介導(dǎo)了賁門癌的發(fā)生發(fā)展。HIF-1α的表達(dá)與賁門癌患者的年齡、性別、腫瘤大小無(wú)相關(guān)性，而與腫瘤的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度和肌層浸潤(rùn)深度密切相關(guān)，說(shuō)明HIF-1α與賁門癌臨床病理學(xué)特征關(guān)系密切，可能影響賁門癌患者的治療和預(yù)后。這一結(jié)果與HIF-1α在其它實(shí)體癌中的表達(dá)類似［6］。

VEGF-C是VEGF家族的新成員，是最早發(fā)現(xiàn)的淋巴管生長(zhǎng)因子，與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞上VEGFR-3特異受體結(jié)合后，激活VEGFR-3引起SHc的磷酸化，促進(jìn)淋巴管上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)移;同時(shí)也可激活Ras/MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路或TNK通路，誘導(dǎo)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞肌動(dòng)蛋白的重組，刺激淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖［7］，誘導(dǎo)瘤周淋巴管生成，從而促進(jìn)腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。Wang等［8］運(yùn)用免疫組化和RT-PCR法分析發(fā)現(xiàn)，VEGF-C的陽(yáng)性表達(dá)與胃癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)。Skobe等［9］通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)使人乳腺癌細(xì)胞株MDA2MB-435過(guò)表達(dá)VEGF-C，再將其植入免疫缺陷小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)瘤周的淋巴管高度增生、擴(kuò)張，促進(jìn)區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。本研究證明，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組VEGF-C的表達(dá)明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，且靠近轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的癌細(xì)胞VEGF-C陽(yáng)性程度高于遠(yuǎn)離淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織的癌細(xì)胞，提示賁門癌中VEGF-C的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)VEGF-C在隨賁門癌浸潤(rùn)深度的增加陽(yáng)性表達(dá)明顯增加。這說(shuō)明VEGF-C在賁門癌的浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著重要的作用。

Tao等［10］發(fā)現(xiàn) HIF-1α 陽(yáng)性的胰腺癌中 VEGF-C的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于HIF-1α陰性的胰腺癌，HIF-1α的表達(dá)與VEGF-C的表達(dá)呈正相關(guān)。Katsuta等［11］研究發(fā)現(xiàn)在食管癌中HIF-1α、VEGF-C的高表達(dá)促進(jìn)了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，且兩者表達(dá)密切相關(guān)。本研究所得結(jié)論與上述研究一致，我們發(fā)現(xiàn)在賁門癌中HIF-1α、VEGFC的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，兩者的表達(dá)呈正相關(guān)(γ=0.826，P ＜0.05)。這提示 HIF-1α 與 VEGF-C在促進(jìn)賁門癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的過(guò)程中起協(xié)同作用，但具體機(jī)制有待深入研究。熒光定量RT-PCR及基因測(cè)序檢測(cè)結(jié)果提示胰腺癌細(xì)胞在基因水平也高表達(dá)HIF-1α、VEGF-C，且分別與 Genbank中 的 已知 序 列BC043769、ID:7424完全一致，說(shuō)明檢測(cè)結(jié)果真實(shí)可靠。

總之，我們運(yùn)用免疫組化、PCR、RT-PCR、基因測(cè)序等技術(shù)從蛋白表達(dá)、RNA轉(zhuǎn)錄、基因序列3個(gè)方面來(lái)證實(shí)賁門癌細(xì)胞中HIF-1α、VEGF-C的表達(dá)情況，進(jìn)一步驗(yàn)證了HIF-1α、VEGF-C高表達(dá)與胰腺癌病情進(jìn)展相關(guān)，并參與賁門癌的浸潤(rùn)和淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移機(jī)制。HIF-1α、VEGF-C作為細(xì)胞表面分子，可能參與了賁門癌的多種生物學(xué)行為，可作為特異性的腫瘤轉(zhuǎn)移或分化標(biāo)志物，在預(yù)測(cè)賁門癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移潛能、治療或預(yù)后判斷方面起重要作用，以HIF-1α、VEGF-C為靶點(diǎn)的治療策略可能能夠抑制腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

［1］孟令新，丁兆軍，陳希平，等.神經(jīng)生長(zhǎng)因子及其受體在人胰腺導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)〔J〕.中華內(nèi)科雜志，2009，48(7):562.

［2］趙 菲，蔡慧云，安 平.缺氧誘導(dǎo)因子-lα在結(jié)腸腫瘤中的表達(dá)及意義〔J〕.中華消化外科雜志，2007，6(2):125.

［3］Griffiths EA，Pritchard SA，Valentine HR，et al.Hypoxia inducible factor-1alpha expression in the gastric carcinogenesis sequence and its prognostic role in gastric and gastro-oe-sophageal adenocarcinomas〔J〕.Br J Cancer，2007，96(1):95.

［4］Ogane N，Yasuda M，Shimizu M，et al.Clinicopathological implications of expressions of hypoxia-related molecules in esophageal superficial squamous cell carcinoma〔J〕.Ann Diagn Pathol，2010，14(1):23.

［5］Tzao C，Lee SC，Tung HJ，et al.Expression of hypoxia-inducible factor(HIF)-1alpha and vascular endothelial growth factor(VEGF)-D as outcome predictors in resected esophageal squamous cell carcinoma〔J〕.Dis Markers，2008，25(3):141.

［6］Denko NC.Hypoxia，HIF1 and glucose metabolism in the solid tumour〔J〕.Nat Rev Cancer，2008，8(9):705.

［7］欒 寧，王雪峰.VEGF-C與腫瘤轉(zhuǎn)移的研究進(jìn)展〔J〕.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2009，17(9):1805.

［8］Wang W，Wu R，Sun G，et al.Expression of VEGF-C and VEGF-D in gastric carcinoma and its relationship with lymph node metastases〔J〕.Zhong Nan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban，2010，35(4):335.

［9］Skobe M，Hawighorst T，Jackson DG，et al.Induction of tumor lymphangiogenesis by VEGF-C promotes breast cancer metastasis〔J〕.Nat Med，2001，7(2):192.

［10］Tao J，Li T，Li K，et al.Effect of HIF-1alpha on VEGF-C induced lymphangiogenesis and lymph nodes metastases of pancreatic cancer〔J〕.J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2006，26(5):562.

［11］Katsuta M，Miyashita M，Makinoa H，et al.Correlation of hypoxia inducible factor-1a with lymphatic metastasis via vascular endothelial growth factor-C in human esophageal cancer〔J〕.Exp Mol Pathol，2005，78(2):123.