強(qiáng)福林 吳徐明 楊自力 崔曉燕 李海波

原發(fā)性肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，近年來的資料特別發(fā)現(xiàn)，至少有80%的肝細(xì)胞肝癌患者有乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染［1，2］。前S1、前S2基因合并稱為前S基因，兩者編碼的蛋白在病毒與細(xì)胞特異性結(jié)合方面起著重要作用。前S區(qū)是HBV 基因組中變異發(fā)生較多的部位［3，4］，研究表明，在HBsAg陽性人群中，有18.3%的人存在前S基因的突變，而中國人突變的比例則高達(dá)22.4%。

南通地區(qū)是我國乙型肝炎的高發(fā)區(qū)，同時(shí)也是我國肝癌的高發(fā)地區(qū)，多年來一直是我國乙型肝炎及肝癌重要的研究現(xiàn)場［5］。我們現(xiàn)就南通地區(qū)肝癌患者血清HBV PreS2區(qū)的缺失突變情況作一研究，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象

HBV無癥狀攜帶者(asymptomatic HBV carriers，ASC)，均為到南通市疾病預(yù)防控制中心進(jìn)行健康體檢者，年齡21～39歲，均未接種過乙型肝炎疫苗，也未使用過任何抗HBV藥物，體檢結(jié)果顯示肝功能均正常。肝癌(hepatocarcinoma，HCC)患者均為南通市腫瘤醫(yī)院住院治療的肝癌患者，年齡42～67歲。上述HBV無癥狀攜帶著和肝癌患者均符合中華醫(yī)學(xué)會傳染病與寄生蟲學(xué)分會、肝病學(xué)分會聯(lián)合修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］，血清樣品均保存于－70℃低溫冰箱。

1.2 主要試劑及引物

肝炎病毒診斷試劑(HBsAg、抗-HAV-IgM、抗-HDV、抗HCV)均購自上?？迫A生物工程股份有限公司，HBV-DNA熒光定量PCR試劑盒購自深圳匹基生物技術(shù)開發(fā)有限公司，谷丙轉(zhuǎn)氨酶 (ALT)試劑盒為Wako公司產(chǎn)品。PreS擴(kuò)增引物根據(jù) PUBMED中HBV序列設(shè)計(jì)，由上海之江生物技術(shù)公司合成。上游引物 P1:5’-TCA CCA TAT TCT TGG GAA CA-3’(2817～2836 nt)，下游引物 P2:5’-GAG AGA AGT CCA CCA CGA GT-3’(252～271 nt)，目的基因長度為670 bp。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

乙型肝炎病毒抗原、抗體，甲型肝炎IgM抗體，丙型肝炎抗體，丁型肝炎抗體，血清ALT，HBV-DNA，均嚴(yán)格按照試劑說明書操作。

HBV PreS基因的擴(kuò)增:采用酚-氯仿法抽提血清DNA，PCR 條件為預(yù)變性 94℃ 25 min，94℃ 20 sec，50℃ 30 sec，72℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)，最后一個(gè)循環(huán)72℃10 min。PCR產(chǎn)物純化后送上海之江生物技術(shù)公司測序，引物為P1。將所測基因序列與HBV不同型PreS序列用DNAMAN軟件比對。

2 結(jié)果

2.1 HBV無癥狀攜帶者和肝癌患者HBV preS2缺失突變情況

在實(shí)驗(yàn)中，首先篩選出甲肝IgM抗體、丙型肝炎抗體和丁型肝炎抗體檢測均為陰性的研究對象，以排除其他肝炎感染對本研究結(jié)果的影響。與HBV無癥狀攜帶組相比較，肝癌組ALT水平顯著增高，而兩組HBV-DNA濃度并無顯著差異。在肝癌組中，23.08%的患者存在PreS2區(qū)的缺失突變，與無癥狀攜帶者比較有顯著差異(表1)。

表1 HBV無癥狀攜帶者和肝癌患者HBV PreS2缺失突變情況

2.2 肝癌患者HBV preS2缺失突變分析

與HBV野毒株相比較，本研究的26例肝癌患者中，有6位存在著HBV preS2區(qū)的缺失突變，缺失長度分別為30～45 bp，對應(yīng)缺失10～15個(gè)氨基酸。缺失的位點(diǎn)在aa 126～141區(qū)域(表2)。

表2 肝癌患者HBV preS2缺失突變病例

3 討論

肝癌的發(fā)病機(jī)理十分復(fù)雜，HBV感染及HBV基因組的多態(tài)性可能顯著影響病毒與宿主的相互關(guān)系及患者的臨床過程，HBV基因組的變異可能與肝癌的發(fā)生、發(fā)展存在某種聯(lián)系。

前S基因與HBV病毒的一些重要生理功能有關(guān)，其變異將影響疾病的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程。前S基因變異，特別是前S2基因起始密碼的變異，可能是導(dǎo)致肝炎重癥化的原因之一。多個(gè)研究小組報(bào)道了前S基因的缺失突變，最長的缺失突變可達(dá)264 bp，最短的為9 bp，研究表明，這大多是由真核細(xì)胞mRNA剪接機(jī)制，以及HBV DNA聚合酶所具有的逆轉(zhuǎn)錄酶活性參與DNA模板轉(zhuǎn)換機(jī)制等造成的部分基因缺失突變［7，8］。

已有研究結(jié)果表明肝癌的發(fā)展與HBV preS2及其突變相關(guān)。HBV preS2可抑制p53而導(dǎo)致肝癌的發(fā)生;HBV preS2突變通過p27(Kip1)的降解而導(dǎo)致了DNA損傷;HBV preS2突變可通過Cdk2途徑而導(dǎo)致視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤抑癌基因過磷酸化［9，10］。

本研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌患者HBV preS2中存在大量的缺失突變，而Genbank收錄的無癥狀攜帶者的preS2基因，以及本研究測定的無癥狀攜帶者的pre-S2基因并無大量缺失突變發(fā)生，提示肝癌患者HBV前S基因?yàn)楦叨茸儺悈^(qū)，而preS2區(qū)的缺失突變則可能與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)。

［1］Liu S，Zhang H，Gu C，et al.Associations between hepatitis B virus mutations and the risk of hepatocellular carcinoma:a meta-analysis〔J〕.J Natl Cancer Inst，2009，101(15):1066

［2］Ferenci P，F(xiàn)ried M，Labrecque D，et al.Hepatocellular carcinoma(HCC):a global perspective〔J〕.J Clin Gastroenterol，2010，44(4):239

［3］Abbas N，Ahmad A，Shakoori AR，et al.Overexpression and purification of PreS region of hepatitis B virus antigenic surface protein adr subtype in Escherichia coli〔J〕.J Biochem Mol Biol，2007，40(6):1002

［4］吳 煒，李蘭娟.HBV前S基因變異及其臨床意義〔J〕.國外醫(yī)學(xué)·流行病學(xué)傳染病分冊，2002，29(4):200

［5］Wang JS，Qian GS，Zarba A，et al.Temporal patterns of aflatoxin-albumin adducts in hepatitis B surface antigen-positive and antigen-negative residents of Daxin，Qidong County，People＇s Republic of China〔J〕.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，1996，5(4):253

［6］中華醫(yī)學(xué)會傳染病與寄生蟲分會、肝病學(xué)分會聯(lián)合修訂.病毒性肝炎防治方案〔J〕.中華傳染病雜志，2001，19(1):56

［7］Huy TT，Ushijima H，Win KM，et al.High prevalence of hepatitis B virus pre-s mutant in countries where it is endemic and its relationship with genotype and chronicity〔J〕.J Clin Microbiol，2003，41(12):5449

［8］王國棠，田庚善.乙型肝炎病毒S/S基因變異及臨床意義〔J〕.中華內(nèi)科雜志，1994，33(4):264

［9］Hsieh Y，Su I，Wang H，et al.Hepatitis B virus pre-S2 mutant surface antigen induces degradation of cyclin-dependent kinase inhibitor p27Kip1 through c-Jun activation domain-binding protein 1〔J〕.Molecular Cancer Research，2007，5(10):1063.

［10］Wang H，Huang W，Lai M，Su I.Hepatitis B virus pre S mutants，endoplasmic reticulum stress and hepatocarcinogenesis〔J〕.Cancer Science，2006，97(8):683