鄭曉娟 胡新榮 唐澤立 李飛虹 龐天云
宮頸癌是嚴(yán)重危害婦女生命健康的惡性腫瘤,全球發(fā)病率居第二位,在我國(guó)則是婦科惡性腫瘤的第一位死亡原因。宮頸癌起源于正常宮頸上皮,進(jìn)而發(fā)展為宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN),再經(jīng)過(guò)幾年或十幾年可發(fā)展為浸潤(rùn)癌[1,2]。因此,尋找與宮頸癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)的分子標(biāo)志,是早期提示、診斷宮頸癌的關(guān)鍵。p16與宮頸癌的關(guān)系是近年來(lái)這一研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。eIF4E位于宮頸腫瘤LOH常發(fā)生的染色體之一的4q24,cDNA長(zhǎng)1 683 bp。在宮頸腫瘤中eIF4E的基因型究竟為何種改變尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用PCR技術(shù)對(duì)宮頸癌中p16及eIF4E進(jìn)行檢測(cè),以期發(fā)現(xiàn)與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)的分子標(biāo)志。
本研究資料取自廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科2004~2006年間手術(shù)切除的41例新鮮宮頸癌標(biāo)本。新鮮組織自患者體內(nèi)取出后,立即送病理科由經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師取材,取材內(nèi)容包括宮頸癌組織和癌旁正常宮頸組織,并裝入凍存管中,置于-80℃冰箱密封保存?zhèn)溆?。切片時(shí)置于-20℃冷凍切片機(jī)中,6~8 μm連續(xù)切片,切片亦置于-80℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>
微量DNA提取試劑盒,p16exon1、eIF4E的引物,瓊脂糖凝膠,50 bp DNA ladder,溴化乙錠(EB)。
實(shí)驗(yàn)所用引物為B-globin(產(chǎn)物長(zhǎng)度:102 bp):S 5 '-gTg CAT CTg ACT CCT gAg gAg A-3 ',A 5 '-CCT TgA TAC CAA CCT gCC CAg-3';p16exon1(產(chǎn)物長(zhǎng)度:269bp):S 5 '-CCT TgC CTg gAA AgA TAC Cg-3 ',A 5 '-gCA CCT CCT CTA CCC gAC CC-3';eIF4E(產(chǎn)物長(zhǎng)度:244bp):S 5 '-AAA Cgg AAT CTA ATC Agg Ag-3 ',A 5 '-CAC ATA ggC TCA ATA CCA TC-3'。
倒置顯微鏡,臺(tái)式離心機(jī),752型紫外分光光度計(jì),PCR擴(kuò)增儀,穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀,紫外透射分析儀。
選取正常宮頸組織和宮頸癌這兩個(gè)起始端和終端,檢測(cè)如下2個(gè)基因:p16exon1,eIF4E。將蘇木精輕染的宮頸癌切片置于倒置顯微鏡載物臺(tái)上,10倍鏡下手持清潔手術(shù)刀片在需要切割的區(qū)域來(lái)回刻劃,用刀片蘸取少量裂解液黏取游離的細(xì)胞,將其轉(zhuǎn)移到裝有200 μl裂解液的凍存管中,細(xì)胞大約蓋滿管底即可,然后使用微量DNA提取試劑盒提取制備DNA。將每一例樣本的正常宮頸組織和癌組織進(jìn)行配對(duì),測(cè)定所提取宮頸癌組織及癌旁正常組織DNA的OD值,在25 μl的PCR反應(yīng)體系中,均統(tǒng)一加入0.8 μg模板DNA。在同一批次分別針對(duì)待檢基因和相應(yīng)的看家基因做PCR,電泳時(shí)在同1個(gè)加樣孔中分別加入兩種產(chǎn)物各8 μl,待電泳結(jié)束后,對(duì)凝膠進(jìn)行染色。按照同樣的方法對(duì)上述2個(gè)基因各重復(fù)檢測(cè)2次。
運(yùn)用bandscan4.3對(duì)電泳圖像中的各個(gè)泳帶進(jìn)行灰度掃描,取兩次實(shí)驗(yàn)灰度值的均值。計(jì)算出待檢基因擴(kuò)增產(chǎn)物灰度值與相應(yīng)看家基因擴(kuò)增產(chǎn)物灰度值的比值,以這一比值作為校正值(相對(duì)灰度),運(yùn)用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,根據(jù)處理結(jié)果確定基因的擴(kuò)增或丟失情況。
抑癌基因p16exon1在宮頸癌中的拷貝數(shù)改變:p16exon1在宮頸癌組織中相對(duì)灰度的均值為0.28,在正常宮頸組織中相對(duì)灰度的均值為0.11。經(jīng)配對(duì)樣本 t檢驗(yàn),t= -2.766,P(雙)=0.028,兩者相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見(jiàn)圖1。
癌基因eIF4E在宮頸癌中的拷貝數(shù)改變:eIF4E在宮頸癌組織中相對(duì)灰度的均值為1.08,在正常宮頸組織中相對(duì)灰度的均值為0.72。經(jīng)配對(duì)樣本t檢驗(yàn),t= -2.744,P(雙)=0.029,兩者相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見(jiàn)圖2。
以下電泳圖中相鄰兩泳道為同一例樣本,奇數(shù)泳道為正常組織,偶數(shù)泳道為癌組織,“M”為50 bp DNA ladder。
圖1 正常宮頸組織與宮頸癌中p16exon1的基因擴(kuò)增情況
圖2 正常宮頸組織與宮頸癌中eIF4E的基因擴(kuò)增情況
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,p16exon1在宮頸癌組織中擴(kuò)增產(chǎn)物的拷貝數(shù)較癌旁正常組織明顯增加,兩者相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從中初步推斷,p16的第1個(gè)外顯子參與了宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。這從基因水平上解釋了p16蛋白表達(dá)增高的原因。以往大多是用免疫組化的方法檢測(cè)p16蛋白的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)p16蛋白的表達(dá)隨著宮頸病變發(fā)展程度的增高,其累積量也逐漸增高,但這并不能揭示p16基因的結(jié)構(gòu)異常。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明,p16exon1的基因結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變,表現(xiàn)為擴(kuò)增,由此可引起其蛋白表達(dá)的增高。p16的第2、3個(gè)外顯子是否也是同樣的情況,尚需進(jìn)一步檢測(cè)。
迄今,在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,對(duì)于p16在基因水平方面的報(bào)道還比較有限。Wong等[3]研究了128例宮頸癌中p16的缺失情況,發(fā)現(xiàn)其中7例有純合性缺失,比例為5%。亦有文獻(xiàn)報(bào)道,采用PCR的方法對(duì)p16的第1和第2個(gè)外顯子進(jìn)行了純合性缺失檢測(cè),得出如下結(jié)果,在60例宮頸癌中,9例有第1或第2個(gè)外顯子的純合性缺失,比例為15%[4]。本實(shí)驗(yàn)即是對(duì)p16在分子水平方面的改變進(jìn)行了初步研究,后續(xù)仍有極大的研究空間,可進(jìn)行更深入的探索。
eIF4E即真核細(xì)胞翻譯起始因子4E,與蛋白合成的起始反應(yīng)有關(guān),其活性受ras,c-myc等基因的正性調(diào)控。在實(shí)體腫瘤發(fā)展中,惡性組織的增殖需要大量蛋白的合成,eIF4E表達(dá)增高屬必然事件。eIF4E作為原癌基因,其作用是通過(guò)加強(qiáng)各種原癌基因的翻譯而實(shí)現(xiàn)的。Lee等[5]運(yùn)用免疫組化的方法發(fā)現(xiàn),eIF4E在正常宮頸鱗狀上皮中沒(méi)有表達(dá),隨著宮頸病變的級(jí)別增高,其表達(dá)逐漸增強(qiáng),且其表達(dá)具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;同時(shí)運(yùn)用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在宮頸腫瘤中eIF4E的表達(dá)較正常宮頸上皮明顯增強(qiáng),其差異亦有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。也有文獻(xiàn)報(bào)道,eIF4E在宮頸腫瘤中的表達(dá)增加,并可促進(jìn)HPV E7基因的表達(dá)[6]。這些都表現(xiàn)了它作為癌基因的特性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,eIF4E在宮頸癌組織中較癌旁正常組織中擴(kuò)增產(chǎn)物的拷貝數(shù)明顯增加,兩者相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從中初步推斷,與正常宮頸組織相比,eIF4E在宮頸癌中表現(xiàn)為擴(kuò)增;并可推測(cè)其蛋白在宮頸癌中亦為過(guò)量表達(dá)。從eIF4E本身的特性(為癌基因)來(lái)講,我們較容易理解其表現(xiàn)為擴(kuò)增的事實(shí)。目前尚未見(jiàn)到有具體研究eIF4E的基因型改變的報(bào)道。
本實(shí)驗(yàn)從基因結(jié)構(gòu)的改變方面表明了p16可以作為宮頸癌發(fā)生發(fā)展的有用的分子標(biāo)志。目前在宮頸癌的研究中,有關(guān)eIF4E的報(bào)道較少,在本實(shí)驗(yàn)中亦是對(duì)其進(jìn)行初步研究,根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,可初步考慮把該基因作為宮頸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的候選分子標(biāo)志。p16第2、3個(gè)外顯子在宮頸癌中的基因改變情況如何,以及eIF4E是否可作為宮頸癌發(fā)生發(fā)展方向的確切分子標(biāo)志,尚需進(jìn)一步研究。
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