鄭曉娟 胡新榮 唐澤立 李飛虹 龐天云

宮頸癌是嚴(yán)重危害婦女生命健康的惡性腫瘤，全球發(fā)病率居第二位，在我國則是婦科惡性腫瘤的第一位死亡原因。宮頸癌起源于正常宮頸上皮，進(jìn)而發(fā)展為宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)，再經(jīng)過幾年或十幾年可發(fā)展為浸潤癌［1，2］。因此，尋找與宮頸癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)的分子標(biāo)志，是早期提示、診斷宮頸癌的關(guān)鍵。p16與宮頸癌的關(guān)系是近年來這一研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。eIF4E位于宮頸腫瘤LOH常發(fā)生的染色體之一的4q24，cDNA長1 683 bp。在宮頸腫瘤中eIF4E的基因型究竟為何種改變尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用PCR技術(shù)對(duì)宮頸癌中p16及eIF4E進(jìn)行檢測(cè)，以期發(fā)現(xiàn)與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)的分子標(biāo)志。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源及處理

本研究資料取自廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科2004～2006年間手術(shù)切除的41例新鮮宮頸癌標(biāo)本。新鮮組織自患者體內(nèi)取出后，立即送病理科由經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師取材，取材內(nèi)容包括宮頸癌組織和癌旁正常宮頸組織，并裝入凍存管中，置于－80℃冰箱密封保存?zhèn)溆?。切片時(shí)置于－20℃冷凍切片機(jī)中，6～8 μm連續(xù)切片，切片亦置于－80℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

微量DNA提取試劑盒，p16exon1、eIF4E的引物，瓊脂糖凝膠，50 bp DNA ladder，溴化乙錠(EB)。

實(shí)驗(yàn)所用引物為B-globin(產(chǎn)物長度:102 bp):S 5 ＇-gTg CAT CTg ACT CCT gAg gAg A-3 ＇，A 5 ＇-CCT TgA TAC CAA CCT gCC CAg-3＇;p16exon1(產(chǎn)物長度:269bp):S 5 ＇-CCT TgC CTg gAA AgA TAC Cg-3 ＇，A 5 ＇-gCA CCT CCT CTA CCC gAC CC-3＇;eIF4E(產(chǎn)物長度:244bp):S 5 ＇-AAA Cgg AAT CTA ATC Agg Ag-3 ＇，A 5 ＇-CAC ATA ggC TCA ATA CCA TC-3＇。

1.3 主要儀器

倒置顯微鏡，臺(tái)式離心機(jī)，752型紫外分光光度計(jì)，PCR擴(kuò)增儀，穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，紫外透射分析儀。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

選取正常宮頸組織和宮頸癌這兩個(gè)起始端和終端，檢測(cè)如下2個(gè)基因:p16exon1，eIF4E。將蘇木精輕染的宮頸癌切片置于倒置顯微鏡載物臺(tái)上，10倍鏡下手持清潔手術(shù)刀片在需要切割的區(qū)域來回刻劃，用刀片蘸取少量裂解液黏取游離的細(xì)胞，將其轉(zhuǎn)移到裝有200 μl裂解液的凍存管中，細(xì)胞大約蓋滿管底即可，然后使用微量DNA提取試劑盒提取制備DNA。將每一例樣本的正常宮頸組織和癌組織進(jìn)行配對(duì)，測(cè)定所提取宮頸癌組織及癌旁正常組織DNA的OD值，在25 μl的PCR反應(yīng)體系中，均統(tǒng)一加入0.8 μg模板DNA。在同一批次分別針對(duì)待檢基因和相應(yīng)的看家基因做PCR，電泳時(shí)在同1個(gè)加樣孔中分別加入兩種產(chǎn)物各8 μl，待電泳結(jié)束后，對(duì)凝膠進(jìn)行染色。按照同樣的方法對(duì)上述2個(gè)基因各重復(fù)檢測(cè)2次。

1.5 電泳圖像分析

運(yùn)用bandscan4.3對(duì)電泳圖像中的各個(gè)泳帶進(jìn)行灰度掃描，取兩次實(shí)驗(yàn)灰度值的均值。計(jì)算出待檢基因擴(kuò)增產(chǎn)物灰度值與相應(yīng)看家基因擴(kuò)增產(chǎn)物灰度值的比值，以這一比值作為校正值(相對(duì)灰度)，運(yùn)用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，根據(jù)處理結(jié)果確定基因的擴(kuò)增或丟失情況。

2 結(jié)果

抑癌基因p16exon1在宮頸癌中的拷貝數(shù)改變:p16exon1在宮頸癌組織中相對(duì)灰度的均值為0.28，在正常宮頸組織中相對(duì)灰度的均值為0.11。經(jīng)配對(duì)樣本 t檢驗(yàn)，t= －2.766，P(雙)=0.028，兩者相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1。

癌基因eIF4E在宮頸癌中的拷貝數(shù)改變:eIF4E在宮頸癌組織中相對(duì)灰度的均值為1.08，在正常宮頸組織中相對(duì)灰度的均值為0.72。經(jīng)配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，t= －2.744，P(雙)=0.029，兩者相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2。

以下電泳圖中相鄰兩泳道為同一例樣本，奇數(shù)泳道為正常組織，偶數(shù)泳道為癌組織，“M”為50 bp DNA ladder。

圖1 正常宮頸組織與宮頸癌中p16exon1的基因擴(kuò)增情況

圖2 正常宮頸組織與宮頸癌中eIF4E的基因擴(kuò)增情況

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，p16exon1在宮頸癌組織中擴(kuò)增產(chǎn)物的拷貝數(shù)較癌旁正常組織明顯增加，兩者相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從中初步推斷，p16的第1個(gè)外顯子參與了宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。這從基因水平上解釋了p16蛋白表達(dá)增高的原因。以往大多是用免疫組化的方法檢測(cè)p16蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)p16蛋白的表達(dá)隨著宮頸病變發(fā)展程度的增高，其累積量也逐漸增高，但這并不能揭示p16基因的結(jié)構(gòu)異常。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，p16exon1的基因結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，表現(xiàn)為擴(kuò)增，由此可引起其蛋白表達(dá)的增高。p16的第2、3個(gè)外顯子是否也是同樣的情況，尚需進(jìn)一步檢測(cè)。

迄今，在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程中，對(duì)于p16在基因水平方面的報(bào)道還比較有限。Wong等［3］研究了128例宮頸癌中p16的缺失情況，發(fā)現(xiàn)其中7例有純合性缺失，比例為5%。亦有文獻(xiàn)報(bào)道，采用PCR的方法對(duì)p16的第1和第2個(gè)外顯子進(jìn)行了純合性缺失檢測(cè)，得出如下結(jié)果，在60例宮頸癌中，9例有第1或第2個(gè)外顯子的純合性缺失，比例為15%［4］。本實(shí)驗(yàn)即是對(duì)p16在分子水平方面的改變進(jìn)行了初步研究，后續(xù)仍有極大的研究空間，可進(jìn)行更深入的探索。

eIF4E即真核細(xì)胞翻譯起始因子4E，與蛋白合成的起始反應(yīng)有關(guān)，其活性受ras，c-myc等基因的正性調(diào)控。在實(shí)體腫瘤發(fā)展中，惡性組織的增殖需要大量蛋白的合成，eIF4E表達(dá)增高屬必然事件。eIF4E作為原癌基因，其作用是通過加強(qiáng)各種原癌基因的翻譯而實(shí)現(xiàn)的。Lee等［5］運(yùn)用免疫組化的方法發(fā)現(xiàn)，eIF4E在正常宮頸鱗狀上皮中沒有表達(dá)，隨著宮頸病變的級(jí)別增高，其表達(dá)逐漸增強(qiáng)，且其表達(dá)具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;同時(shí)運(yùn)用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在宮頸腫瘤中eIF4E的表達(dá)較正常宮頸上皮明顯增強(qiáng)，其差異亦有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。也有文獻(xiàn)報(bào)道，eIF4E在宮頸腫瘤中的表達(dá)增加，并可促進(jìn)HPV E7基因的表達(dá)［6］。這些都表現(xiàn)了它作為癌基因的特性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，eIF4E在宮頸癌組織中較癌旁正常組織中擴(kuò)增產(chǎn)物的拷貝數(shù)明顯增加，兩者相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從中初步推斷，與正常宮頸組織相比，eIF4E在宮頸癌中表現(xiàn)為擴(kuò)增;并可推測(cè)其蛋白在宮頸癌中亦為過量表達(dá)。從eIF4E本身的特性(為癌基因)來講，我們較容易理解其表現(xiàn)為擴(kuò)增的事實(shí)。目前尚未見到有具體研究eIF4E的基因型改變的報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)從基因結(jié)構(gòu)的改變方面表明了p16可以作為宮頸癌發(fā)生發(fā)展的有用的分子標(biāo)志。目前在宮頸癌的研究中，有關(guān)eIF4E的報(bào)道較少，在本實(shí)驗(yàn)中亦是對(duì)其進(jìn)行初步研究，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可初步考慮把該基因作為宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中的候選分子標(biāo)志。p16第2、3個(gè)外顯子在宮頸癌中的基因改變情況如何，以及eIF4E是否可作為宮頸癌發(fā)生發(fā)展方向的確切分子標(biāo)志，尚需進(jìn)一步研究。

［1］Spitzer M，Apgar B，Brotzman G.Management of histologic abnormalities of the cervix〔J〕.Am Fam Physician，2006，73(1):105.

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［3］Wong YF，Chung TK，Cheung TH，et al.p16INK4 and p15-INK4B alterations in primary gynecologic malignancy〔J〕.Gynecol Oncol，1997，65(2):319.

［4］Yuan JR，Li Y，Hu SJ，et al.Methylation and aberrant expression of thep16 gene in cervical carcinoma〔J〕.HEREDITAS(Beijing)，2005，27(1):39.

［5］Lee JW，Choi JJ，Lee KM，et al.eIF-4E expression is associated with histopathologic grades in cervical neoplasia〔J〕.Hum Pathol，2005，36(11):1197.

［6］Matthews-Greer J，Caldito G，de Benedetti A，et al.eIF4E as a marker for cervical neoplasia〔J〕.Appl Immunohistochem Mol Morphol，2005，3(4):367.