王巍巍 黃大毛 王 雷 謝春蕾 唐發(fā)清

鼻咽癌是我國和東南亞1種常見的頭頸部惡性腫瘤。EB病毒的感染與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關［1，2］，在絕大多數(shù)鼻咽癌組織中可檢測到 EBVDNA，鼻咽癌患者血漿EBV-DNA 檢出率為94.1%［3］，EBV-DNA是鼻咽癌診斷和判斷復發(fā)、轉移的重要血清學標記物。而鼻咽癌患者血漿中EBV-DNA的來源目前尚不清楚，本文定量檢測鼻咽癌患者血漿EBV-DNA拷貝數(shù)，并分析其與鼻咽癌細胞凋亡的相關性，為闡明鼻咽癌患者血漿中EBV-DNA的來源提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

鼻咽癌患者28例為2006年5月至2008年1月中南大學湘雅醫(yī)院耳鼻喉科收治的患者，經(jīng)臨床和病理檢查確診為鼻咽低分化鱗癌，其中男性16例，女性12例，年齡27～61(43.7±9.0)歲。每個患者收集病理組織切片，同時采集EDTA-Na2抗凝血3～5 ml。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準品制備 取Raji細胞凍存液進行細胞計數(shù)，根據(jù)文獻［4］報道每個Raji細胞約含有50個拷貝的EBV-DNA進行計算，得到Raji細胞凍存液中EBVDNA 濃度為6.95 ×105copies/μl。

1.2.2 巢式熒光定量PCR檢測血漿中EBV-DNA使用病毒DNA小量抽提試劑盒(上海生工生物工程技術有限公司產品)，分別從血漿和標準品中抽提病毒DNA，操作步驟按試劑盒說明書(稍加改進)進行。選擇EB病毒DNA全序列20206～20426位為外擴增區(qū)，20279～20343位為內擴增區(qū)，熒光探針在內擴增區(qū)內20299～20318位。外擴增引物:上游引物為5’-TCAAAACTTTAGAGGCGAATGG-3’;下游引物為 5’-CTGAGAAGGTGGCCTAGCAAC-3’;擴增片段長度為221 bp。內擴增引物:上游引物 為 5’-CCAGGAAGCGGGTCTATGG-3’;下游引物為 5’-GGCTTA TTCCTCTTTTCCCCTCTA-3’;擴增片段長度為65 bp。熒光探針:Taqman探針序列5’-FAM-TGGCTGCGCTGCTGCTATC-TAMRA-3’。擴增引物、探針由廣州達安基因股份有限公司設計合成。標準品的外擴增反應體系及反應條件:將Raji細胞抽提的EBV-DNA稀釋成一定濃度梯度(1 ×108、1 ×107、1 ×106、1 ×105、1 ×104、1 ×103、1 × 102/50 μl反應體系)。50 μl反應體系:5 × 定性緩沖液10 μl，Taq DNA 聚合酶1 μl，dNTPs 1 μl，上游外引物 1 μl，下游外引物 1 μl，標準品 n μl(n為根據(jù)濃度計算的體積)，加水補至50 μl。反應條件:95℃ 5 min;95℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，30 個循環(huán);72℃7 min。血漿樣品的外擴增反應體系及反應條件。50 μl反應體系:5 × 定性緩沖液 10 μl，Taq DNA 聚合酶 1 μl，dNTPs 1 μl，上游外引物 1 μl，下游外引物 1 μl，模板 10 μl，加水補至 50 μl。反應條件:95℃ 5 min;95℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，30 個循環(huán);72℃ 7 min。內擴增反應體系及反應條件:標準品與患者血漿樣品相同。50 μl反應體系:5×定量緩沖液10 μl，Taq DNA 聚合酶 1 μl，dNTPs 1 μl，上游內引物1 μl，下游內引物 1 μl，Taqman 探針 1 μl，外擴增產物5 μl，加水補至 50 μl。反應條件:95℃ 5 min;95℃45 s，55℃ 45 s，40 個循環(huán)。

1.2.3 鼻咽癌細胞凋亡檢測 采用末端脫氧核苷酸轉移酶介導核苷酸缺口標記法，檢測鼻咽癌細胞凋亡情況，操作按照In Situ Cell Death Detection Kit(Roche Diagnostics)試劑盒說明書進行。清潔載玻片經(jīng)250℃烘烤4 h后，用2%3-氨丙基三乙氧基硅烷(APES)丙酮液處理，鼻咽癌組織石蠟包埋4 μm切片后，置于處理后的載玻片上。二甲苯中脫蠟，乙醇水化，0.25%蛋白酶K消化后加入TUNEL反應液，濕盒中孵育37℃ 60 min，PBS洗滌后加1%Anti-FITC/AP，37℃濕盒中孵育30 min，PBS洗滌后加2%BCIP/NBT，于暗濕盒中顯色，1%甲基綠復染，流水沖洗后烤干，中性樹酯封片，顯微鏡下觀察。陽性細胞的細胞核或細胞質出現(xiàn)紫藍色顆粒，以反應性增生的淋巴結作為陽性對照，在高倍視野下，對每例組織切片中癌組織區(qū)域連續(xù)數(shù)1 000個細胞，計算其中陽性細胞所占比率，即凋亡指數(shù)(apopototic index，AI)。

1.3 統(tǒng)計學處理

應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用Spearman秩相關及檢驗。

2 結果

2.1 鼻咽癌患者中血漿EBV-DNA的表達

應用巢式熒光定量PCR方法，檢測患者血漿EBV-DNA，以Raji細胞作為標準品對EBV-DNA進行相對定量，計算不同患者血漿EBV-DNA的拷貝數(shù)及血漿EBV-DNA中位數(shù)。結果顯示，鼻咽癌患者血漿EBV-DNA檢出率為96.4%(27/28)，中位數(shù)為1 800 copies/μl(0 ～22 100 copies/μl)。

2.2 鼻咽癌細胞凋亡檢測

應用TUNEL方法檢測鼻咽癌細胞凋亡，陽性細胞的細胞核或細胞質出現(xiàn)藍紫色顆粒。光鏡下用高倍視野，對每例組織切片癌組織區(qū)域連續(xù)數(shù)1000個細胞，計算其中陽性細胞所占比例，即凋亡指數(shù)。結果顯示，28例鼻咽癌活檢組織中腫瘤細胞平均凋亡指數(shù)為30.0 ±18.0。

2.3 鼻咽癌患者血漿EBV-DNA與細胞凋亡的相關性

排除EBV-DNA陰性患者及細胞凋亡指數(shù)為陰性患者，鼻咽癌患者中血漿EBV-DNA水平與細胞凋亡呈正相關性(γ =0.927，P ＜0.05)(圖1)。

圖1 鼻咽癌患者EBV-DNA水平與細胞凋亡指數(shù)的相關性

3 討論

EB病毒是1種全球廣為分布、普遍存在的人皰疹病毒，大約90%的人群感染EB病毒。EB病毒感染后主要以潛伏感染的方式存在，介導一些與細胞生長、腫瘤形成有關的重要基因異常表達，從而促使細胞惡性轉化，導致腫瘤發(fā)生(如鼻咽癌、Burkitt’s和Hodfkin’s淋巴瘤等)［5］。EB病毒與鼻咽癌關系密切，在絕大多數(shù)鼻咽癌患者癌細胞中均存在EB病毒基因組成分［6］，大量研究表明鼻咽癌患者血漿中可以檢測到游離的 EBV-DNA［7，8］，EBV-DNA 已經(jīng)成為鼻咽癌早期診斷和臨床分期的重要指標之一［9，10］。本研究中，我們應用Raji細胞中EB病毒基因線性整合在宿主細胞中、每個Raji細胞約含50～60個拷貝的EB病毒基因［4］的特點，制備不同濃度的EBV-DNA標準品，然后采用巢式熒光定量PCR方法，對鼻咽癌患者血漿樣本進行定量分析，結果顯示鼻咽癌患者血漿EBV-DNA檢出率為96.4%，與文獻報道的一致，而且EBV-DNA定量檢測的直觀數(shù)據(jù)將為鼻咽癌的療效評價和復發(fā)、轉移監(jiān)測提供直接依據(jù)［11］。

鼻咽癌患者血漿EBV-DNA檢測的重要性已得到普遍認可，然而血漿中EBV-DNA的來源一直是人們爭議的熱點。最初學者認為，在鼻咽癌外周血中能檢測到EB病毒DNA是因為在外周單個核細胞中存在BE病毒復制，但這與EB病毒DNA水平變化與鼻咽癌腫瘤的消長相關相悖。隨后研究發(fā)現(xiàn)鼻咽癌患者血漿存在大量游離于細胞外的的 EBV-DNA，并發(fā)現(xiàn)EBV-DNA隨著腫瘤消長而變化，在腫瘤消退和持續(xù)緩解后EBV-DNA降低，而在腫瘤惡化、復發(fā)和擴散轉移時EBV-DNA升高［12］，由此推測血漿EBV-DNA與鼻咽癌瘤體組織有關。進一步研究表明，EBV主要分布于鼻咽上皮中，在鼻咽上皮細胞中病毒基因組自身環(huán)化形成附加體，融合于宿主細胞DNA的單一末端，隨著細胞的復制而同步進行復制，僅少數(shù)分布于外周血白細胞［13］。鼻咽癌患者血清EBV-DNA有可能是從攜帶EBV鼻咽癌細胞中釋放出來的。

為進一步明確鼻咽癌患者血清EBV-DNA來源鼻咽癌細胞，本項目對比分析了鼻咽癌患者血清EBVDNA和鼻咽癌細胞凋亡間關系，以探討血清 EBVDNA來源于凋亡的鼻咽癌細胞。本實驗采用TUNEL法檢測鼻咽癌細胞凋亡情況，巢式熒光定量PCR法檢測EBV-DNA拷貝數(shù)，分析血清EBV-DNA與鼻咽癌細胞凋亡數(shù)的相關性。結果發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌患者血漿中EBV-DNA拷貝數(shù)與癌細胞凋亡數(shù)呈正相關，提示EBV-DNA可能部分來源于凋亡的腫瘤細胞。有學者曾經(jīng)提出血漿EBV-DNA可能是腫瘤細胞凋亡的標志［14］，最近研究表明鼻咽癌患者外周血單個核細胞中的EB病毒DNA也可能來源于凋亡的腫瘤細胞［15］。因而，我們認為，鼻咽癌患者血漿中的EBV-DNA可能來源于凋亡的腫瘤細胞，但EBV-DNA從凋亡的腫瘤細胞進入血循環(huán)系統(tǒng)的機制尚需進一步研究。

EBV感染可以抑制鼻咽癌患者細胞免疫功能，使病情進一步發(fā)展［16］，EBV-DNA作為鼻咽癌腫瘤細胞凋亡的指標，可以通過定量檢測患者血漿EBV-DNA來提示腫瘤消長情況，因而，血漿EBV-DNA，可以作為鼻咽癌早期診斷、療效評價、檢測復發(fā)轉移以及高危人群預防的1項重要指標。

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