樊 輝 李國權 謝冰冰 陳英海 李小龍 鄒麗娟

放射治療是抗腫瘤治療的主要治療方法之一，通過放療和增敏劑的聯(lián)合應用提高放療療效，是基礎和臨床研究的熱點。β-欖香烯是從姜科植物溫郁金中提取出來的抗癌新藥，是1種高效、低毒的廣譜抗腫瘤藥物，而且β-欖香烯的放療增敏作用已經(jīng)得到證實，但是放射增敏機制仍未完全闡明。我們通過探討β-欖香烯對移植瘤的放療增敏機制，是否與血管形成相關，從而為闡明增敏機制提供新的理論依據(jù)和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系和裸鼠 A549人肺腺癌細胞系購自中國醫(yī)學科學院細胞庫。6～8周齡的BALB/C-nu裸鼠購自大連醫(yī)科大學實驗動物中心，恒溫(24℃ ～26℃)飼養(yǎng)?；\具、墊料、飲水及飼料均作高壓和紫外線消毒處理。

1.1.2 主要試劑 β-欖香烯注射液購于大連華立金港藥業(yè)有限公司。VEGF、CD34多克隆抗體、生物素標記山羊抗兔和山羊抗鼠IgG及SP染色試劑盒，均購自于北京中杉公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 細胞置于37℃、5%飽和濕度CO2培養(yǎng)箱中，用PRMI 1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，每2～3 d換液1次，定期傳代。

1.2.2 移植瘤模型 取對數(shù)生長期細胞，應用無血清培養(yǎng)基配備細胞懸液，最終細胞濃度為1×107個/0.2 ml;裸鼠右下肢外側皮下注入0.2 ml瘤細胞懸液。應用游標卡尺由專人定期測量瘤體的長徑(a)及短徑(b)，計算移植瘤體積(V=ab2/2［1］)。

1.2.3 照射方式 將荷瘤裸鼠裝入一有機玻璃盒內(nèi)，接種腫瘤的后腿拉出用膠布固定。腫瘤部位位于照射野中央，距野邊緣均超過1 cm，全身其余部位均在野外。Varian 2 300C/D醫(yī)用直線加速器，6 MeV電子線，照射野4 cm×3 cm，劑量5 Gy，源皮距100 cm，照射部位上墊1.0 cm厚蠟塊。

1.2.4 腫瘤生長延緩時間和計算增敏系數(shù) 待移植瘤體積達0.8～1.0 cm3時，將荷瘤裸鼠隨機分組:空白組(NaCl)、25 mg/kg藥物組、45 mg/kg藥物組、100 mg/kg藥物組、放療組(NaCl+放療)、25 mg/kg+放療組、45 mg/kg+放療組、100 mg/kg+放療組，每組5只。腹腔注射β-欖香烯，空白組注射同等體積生理鹽水。與放療聯(lián)合時，β-欖香烯于放療前1h腹腔注射。觀測移植瘤的體積倍增時間，絕對腫瘤生長延緩時間(AGD)=放療組體積倍增時間－空白組體積倍增時間。標準化腫瘤生長延緩時間(NGD)=聯(lián)合組體積倍增時間－藥物組體積倍增時間。增敏系數(shù)(EF)=NGD/AGD，EF＞1提示有放射增敏效應［2］。

1.2.5 移植瘤取材 再次將瘤體達到0.8～1.0 cm3的新裸鼠隨機分組，具體:空白組(NaCl);藥物組(最佳增敏劑量)、放療組、藥物+放療組。24 h后采用斷頸法處死裸鼠，立刻置于冰上，用無菌手術器具剝?nèi)∧[瘤組織，去除脂肪等非瘤組織，置于保存管里于液氮罐保存。

1.2.6 石蠟切片制備及VEGF、CD34免疫組化染色新鮮腫瘤標本常規(guī)石蠟包埋，切成4 μm厚連續(xù)切片。采用SP法免疫組化染色，按照試劑盒說明書進行操作。采用IPP軟件(Image-Pro Plus 6.0)對VEGF的染色結果進行分析，選擇測量面積計算累積光密度及平均光密度［3］。參照 Weidner［4］微血管計數(shù)法標準，根據(jù)CD34染色陽性細胞，計數(shù)MVD平均數(shù)目。

1.3 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 16.0統(tǒng)計分析軟件，采用單因素方差分析方法，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組裸鼠移植瘤的體積倍增時間

實驗前各組瘤體積差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。隔日檢測移植瘤體積變化，計算各組的體積倍增時間。由圖1可見，各藥物組與空白組(6.8±1.10)比較倍增時間均延長，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。藥物組間倍增時間比較，100 mg/kg組(17.2±1.92)最長，45 mg/kg 組(10.6 ± 1.14)次之，25 mg/kg組(9.0 ±0.71)最短，差異具有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。放療組倍增時間(11.8 ±0.45)短于 100 mg/kg組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，長于 45 mg/kg組，兩者比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

圖1 各實驗組的體積倍增時間

2.2 增敏系數(shù)(EF)和最佳增敏劑量

根據(jù)NGD和AGD計算增敏系數(shù)，由于25 mg/kg組EF=0.84＜1，提示該劑量沒有放療增敏作用。45 mg/kg組(EF=1.24)和 100 mg/kg組(EF=2.04)的EF值均＞1，說明兩種劑量具有增敏作用。由圖1可見，100 mg/kg β-欖香烯的抑瘤能力超過了放療的抑瘤能力，說明該劑量抑瘤能力過強，因此不是理想的增敏劑量。45 mg/kg符合放射增敏劑量的要求。

2.3 各組移植瘤VEGF免疫組化表達

顯微鏡下觀察細胞質(zhì)染色呈棕黃色或棕褐色者為VEGF表達陽性。依據(jù)累積光密度及平均光密度結果分析各組VEGF的表達水平，見表1。累積光密度結果:藥物組VEGF表達水平略低于空白組，但是兩者差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);放療組與空白組及藥物組比較，VEGF表達明顯增強，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，聯(lián)合組與空白組、藥物組及放療組比較VEGF表達明顯減弱，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。各組平均光密度分析結果與累積光密度結果一致。

表1 各組VEGF免疫組化染色結果的IPP圖像分析(s)

表1 各組VEGF免疫組化染色結果的IPP圖像分析(s)

★為與空白組、藥物組比較，P＜0.01;◆為與其它各組比較，P＜0.01

組別 樣本數(shù)(n)累積光密度 平均光密度(×10－2)空白組◆

2.4 移植瘤CD34免疫組化表達

參照Weidner微血管計數(shù)法標準，以細胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色著色為血管內(nèi)皮細胞陽性。CD34免疫組化結果見表2。藥物組的微血管個數(shù)表達略低于空白組，但兩者差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);放療組與空白組及藥物組比較，微血管個數(shù)表達明顯增強，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，聯(lián)合組與空白組、藥物組及放療組比較，微血管個數(shù)表達明顯減弱，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.01)。

表2 各組CD34免疫組化染色結果

3 討論

β-欖香烯是從中藥莪術中提取出來的具有抗癌活性的藥物，由于其高效，低毒，廣譜的特點越來越多的受到臨床治療的青睞?；A研究證明β-欖香烯對肺腺癌 A549［5］、小鼠移植瘤 U14［6］等多種細胞均具有放射增敏作用。放射增敏機制研究主要涉及到細胞周期、細胞凋亡及 DNA 雙鏈損傷修復等方面［7，8］，而且主要是體外實驗。體內(nèi)實驗及在腫瘤血管形成機制方面研究甚少。

VEGF是目前發(fā)現(xiàn)的活性和專屬性最強的血管生成因子［9］，廣泛表達于腫瘤細胞，在腫瘤血管形成機制方面發(fā)揮至關重要的作用，所以我們選擇了VEGF做為研究的主要目標。VEGF的表達與腫瘤微血管密度(MVD)緊密相關［10］，所以本實驗著重研究β-欖香烯的放療增敏機制與VEGF和MVD表達的相關性。

本實驗的前期整體實驗發(fā)現(xiàn)，45 mg/kg藥物組劑量本身的抑瘤能力較弱，而增敏系數(shù)(EF=1.24)較理想，所以選擇此劑量作為進一步研究的增敏劑量。從本實驗的結果也可看出:藥物組VEGF的免疫組化表達與空白組比較差異不大，無統(tǒng)計學意義。Moeller等［11］研究表明放療會誘導腫瘤HIF-1α表達上調(diào)，從而促進其下游眾多分子(如VEGF等)的表達。本實驗結果也證明了這一點，VEGF免疫組化結果可看出放療組表達明顯增強，與空白對照組有明顯差異。而聯(lián)合組VEGF表達水平明顯低于其他各組。CD34各組表達與VEGF表達結果基本吻合。這說明了β-欖香烯和放療協(xié)同，通過抑制VEGF表達，改善腫瘤的血管形成情況，增強了腫瘤細胞的放射敏感性，其機制可能是通過下調(diào)VEGF表達改善了腫瘤的乏氧狀態(tài)，值得進一步研究。

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