陳源源，沈 微，石貴陽，王正祥，*

（1.江南大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122；2.江南大學(xué)中國高校工業(yè)微生物資源與信息中心，江蘇無錫214122）

兩種分子標(biāo)識(shí)在酵母分子鑒定中的比較

陳源源1，2，沈 微1，2，石貴陽1，2，王正祥1，2，*

（1.江南大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122；2.江南大學(xué)中國高校工業(yè)微生物資源與信息中心，江蘇無錫214122）

rDNA序列同源性分析是一種通用的酵母分子鑒定方法，26S rDNA D1/D2區(qū)域和rDNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal Transcribed Spacer，ITS）是rDNA序列同源性分析中最為常用的兩種分子標(biāo)識(shí)。同時(shí)使用這兩種分子標(biāo)識(shí)對(duì)20株分離自水果表面的酵母菌株進(jìn)行分子鑒定，結(jié)果顯示19株酵母分離物的鑒定結(jié)果相一致，兩種分子標(biāo)識(shí)序列在認(rèn)定酵母種內(nèi)和種間關(guān)系時(shí)都擁有足夠的差異，能將大部分酵母菌株直接鑒定到種一級(jí)水平。

酵母鑒定，26S rDNA D1/D2區(qū)域序列，ITS序列，分子標(biāo)識(shí)

酵母是一類重要的微生物資源，廣泛應(yīng)用于釀酒、醬油、制醋、維生素和食物焙烤等領(lǐng)域，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。對(duì)酵母菌株進(jìn)行分類鑒定是實(shí)現(xiàn)其資源化的基礎(chǔ)，傳統(tǒng)的酵母鑒定方法主要依靠形態(tài)學(xué)觀察和生理生化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。由于酵母一般以單細(xì)胞形式存在，可用于種屬鑒定的形態(tài)特征較少，因此僅依靠形態(tài)觀察難以對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。而酵母生理生化鑒定方法需要多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，完成整個(gè)鑒定過程往往需要數(shù)周的時(shí)間［1］。目前多種分子生物學(xué)方法已被用于酵母的分類鑒定，如DNA限制性片段多態(tài)性分析（PCR-RFLP）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分析（RAPD）、脈沖電泳核型分析（PFGE）以及核糖體DNA（rDNA）序列同源性分析等［2］。隨著 PCR和DNA測(cè)序技術(shù)的普及，rDNA序列同源性比對(duì)分析被廣泛用于酵母的分類研究，結(jié)合GenBank數(shù)據(jù)庫中大量的rDNA序列信息，可以快速準(zhǔn)確地對(duì)酵母菌株進(jìn)行種屬鑒定［3-4］。26S rDNA的D1/D2區(qū)域序列以及ITS序列是目前酵母分子鑒定中最常用的兩種分子標(biāo)識(shí)。一般認(rèn)為，同種酵母不同菌株之間的26S rDNA D1/D2區(qū)域序列的核苷酸差異小于1%，而在不同種酵母之間則存在著較高的差異，因此該區(qū)域序列可用于酵母的種屬鑒定［5-6］。酵母的ITS序列位于26S和5.8S以及5.8S和18S rDNA之間，屬于高度可變的區(qū)域，適用于親緣關(guān)系較近的菌株間的分類研究［7-8］。本文提取20株酵母分離物的基因組DNA后，分別擴(kuò)增其26S rDNA D1/D2及ITS區(qū)域序列，核苷酸測(cè)序后將測(cè)序結(jié)果提交至NCBI-BLAST網(wǎng)站進(jìn)行同源性比對(duì)，通過兩種分子標(biāo)識(shí)同時(shí)對(duì)20株酵母分離物進(jìn)行分子鑒定，以比較兩者的鑒定結(jié)果及其在分子鑒定中的辨別度差異。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

研究中使用的20株酵母菌株 分離自新疆和云南的水果樣品表面，經(jīng)反復(fù)劃線純化后以甘油管形式保藏于江南大學(xué)中國高校工業(yè)微生物資源與信息中心（http：//cicim-cu.jiangnan.edu.cn），編號(hào)為CICIM Y1-Y20；Taq DNA聚合酶、dNTP Mixture和DL-2000 DNA marker 寶生物（大連）有限公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒 美國OMEGA公司；BigDye Terminator v3.1試劑盒 美國Applied Biosystems公司；其它試劑 國產(chǎn)分析純；引物 委托上海Sangon公司進(jìn)行合成；酵母26S rDNA D1/D2區(qū)域通用引物序列［9］（pNL1：5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′，pNL4：5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′）；ITS序列通用引物序列［10］（pITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，pITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。

Tprofessional PCR儀 德國Biometra公司；1-15臺(tái)式高速離心機(jī) 德國Sigma公司；Vortex Genius 3振蕩器 德國IKA公司；HB100恒溫金屬浴 杭州博日科技有限公司；水平電泳儀 北京六一廠；Alpha EC凝膠成像系統(tǒng) 美國Alpha Innotech公司；3130基因測(cè)序儀 美國Applied Biosystems公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 將20株待鑒定酵母分離物從甘油保藏管中接出，在YPD培養(yǎng)基平板上劃線，30℃培養(yǎng)48h。

1.2.2 酵母基因組DNA的制備 參照文獻(xiàn)［11］中的基因組DNA提取方法進(jìn)行。

1.2.3 26S rDNA D1/D2區(qū)域序列和ITS序列的PCR擴(kuò)增 擴(kuò)增酵母26S rDNA D1/D2區(qū)域序列時(shí)，在PCR薄壁管中加入酵母基因組DNA 1μL、10×PCR緩沖液5μL、2.5mol/L dNTP Mixture 4μL、20μmol/L的26S rDNA D1/D2區(qū)域序列上下游通用引物各0.5μL、Taq DNA聚合酶0.5μL，補(bǔ)無菌水至50μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，52℃退火1min，72℃延伸1min，經(jīng)過30個(gè)循環(huán)后，72℃再延伸10min。

擴(kuò)增酵母ITS序列時(shí)，在50μL PCR反應(yīng)體系中加入酵母基因組DNA 1μL、10×PCR緩沖液5μL、2.5mol/L dNTP Mixture 4μL、20μmol/L的ITS區(qū)域序列上下游通用引物各0.5μL、Taq DNA聚合酶0.5μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，54℃退火1min，72℃延伸1min，經(jīng)過30個(gè)循環(huán)后，72℃再延伸10min。

擴(kuò)增結(jié)束后取5μL PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)，電泳后使用凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察。PCR產(chǎn)物純化參照PCR產(chǎn)物純化試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.4 核苷酸序列測(cè)定及BLAST比對(duì) 核苷酸序列測(cè)定參照BigDye Terminator v3.1試劑盒說明書進(jìn)行。將測(cè)序結(jié)果用Sequence Scanner V1.0軟件進(jìn)行分析，查看序列的長度及可信度。選擇測(cè)序結(jié)果中可信度高的區(qū)域，提交至 NCBI-BLAST網(wǎng)站（http：// blast.ncbi.nlm.nih.gov）進(jìn)行比對(duì)，得到與該序列同源性最高的菌種名稱。

2 結(jié)果與討論

2.1 酵母菌株26S rDNA D1/D2區(qū)域和ITS序列擴(kuò)增結(jié)果

電泳PCR產(chǎn)物后發(fā)現(xiàn)，20株酵母的26S rDNA D1/D2區(qū)域和ITS序列均得到了有效擴(kuò)增。20株酵母分離物的26S rDNA D1/D2區(qū)域序列的大小均在600bp左右（圖1）；而不同酵母菌株的ITS序列的大小存在明顯差異，介于500～800bp之間（圖2），該現(xiàn)象應(yīng)該與酵母ITS區(qū)域不加入成熟核糖體，在進(jìn)化過程中承受的自然選擇壓力較小，能容忍更多的序列插入和缺失有關(guān)［12］。

圖1 20株酵母分離物26S rDNA D1/D2區(qū)域序列PCR產(chǎn)物電泳圖

圖2 20株酵母分離物ITS序列PCR產(chǎn)物電泳圖

2.2 核苷酸測(cè)序及BLAST比對(duì)結(jié)果分析

分析測(cè)序結(jié)果后，選擇其中的可信區(qū)域序列提交至NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST比對(duì)，得到與該序列同源性最高的菌株名稱。20株酵母分離物的26S rDNA D1/D2區(qū)域序列以及ITS序列的同源性比對(duì)結(jié)果如表1所示。

表1 兩種分子標(biāo)識(shí)對(duì)20株酵母菌種的鑒定結(jié)果

經(jīng)BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)，26S rDNA D1/D2區(qū)域序列和ITS序列對(duì)其中19株酵母分離物的鑒定結(jié)果一致，且兩者在分子鑒定中的辨別度大致相同，能將18株酵母分離物直接鑒定到種。Y10菌株的26S rDNA D1/ D2序列與Candida metapsilosis、Candida orthopsilosis和Candida parapsilosis等3種酵母的26S rDNA D1/D2序列的同源性均為100%，而該菌株的 ITS序列與Candida metapsilosis、Candida orthopsilosis和 Candida parapsilosis的 ITS序列的同源性也均為最高，達(dá)到99.09%，兩種分子標(biāo)識(shí)都只能將該菌株鑒定到Candida屬。

兩種分子標(biāo)識(shí)對(duì)Y14菌株的鑒定結(jié)果不一致，該菌株的26S rDNA D1/D2序列與Candida davisiana MO-Y18菌株26S rDNA D1/D2序列的同源性最高，為100%；而其ITS序列與Sporobolomyces lactosus菌株的ITS序列的同源性最高，為99.80%。上述鑒定差異需要結(jié)合其它分子標(biāo)識(shí)以及生理生化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步分析研究，以確定該酵母菌株的種屬。

研究中還發(fā)現(xiàn)，目前DNA測(cè)序獲得的酵母26S rDNA D1/D2區(qū)域及ITS區(qū)域的核苷酸序列一般都是直接提交到GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對(duì)后確定其種屬，但由于GenBank數(shù)據(jù)庫對(duì)上傳的序列信息缺乏有效的驗(yàn)證，導(dǎo)致其中存在著一些不準(zhǔn)確甚至是錯(cuò)誤的信息［13］。因此在BLAST查詢比對(duì)時(shí)，需要對(duì)數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行篩選，應(yīng)盡量選擇已有文章發(fā)表的可靠序列進(jìn)行同源性比對(duì)，以保證鑒定結(jié)果的可靠性。

3 結(jié)論

本文同時(shí)利用26S rDNA D1/D2區(qū)域以及ITS序列對(duì)20株酵母分離物進(jìn)行分子鑒定，發(fā)現(xiàn)這兩種分子標(biāo)識(shí)對(duì)19株酵母分離物的鑒定結(jié)果相同，且兩種分子標(biāo)識(shí)序列在認(rèn)定酵母種內(nèi)和種間關(guān)系時(shí)都擁有足夠的差異，能將大部分酵母菌株直接鑒定到種一級(jí)水平；但兩者對(duì)Y14菌株的鑒定結(jié)果存在差異。因此在進(jìn)行酵母分子鑒定時(shí)，最好能同時(shí)使用26S rDNA D1/D2區(qū)域以及ITS序列對(duì)菌株進(jìn)行同源性比對(duì)分析，綜合兩種分子標(biāo)識(shí)的比對(duì)結(jié)果來確定菌株的種屬，以增加鑒定的準(zhǔn)確性。

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Comparison of two molecular markers in yeast molecular identification

CHEN Yuan-yuan1，2，SHEN Wei1，2，SHI Gui-yang1，2，WANG Zheng-xiang1，2，*
（1.The Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Cultureamp;Information Center of Industrial Microorganism of China Universities，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

rDNA sequence-based alignment and analysis is a widely used method for yeast molecular identification.D1/D2 domain of 26S rDNA and internal transcribed spacer（lTS）belong to the most important molecular markers in yeast identification.Both of these molecular markers of 20 yeast isolates were amplified by PCR assay and compared with alignment sequences in the GenBank databases using the BLAST program.Results showed that 19 out of 20 yeast isolates were consistent between two molecular identification methods，and both of these molecular markers exhibited enough differences between yeasts that it can be used in the discrimination of intra-and inter-species relationships.

yeast identification；D1/D2 domain of 26S rDNA；lTS region；molecular marker

Q789

A

1002-0306（2011）02-0175-03

2010-10-29 *通訊聯(lián)系人

陳源源（1983-），男，博士研究生，研究方向：微生物資源。

國家自然資源科技平臺(tái)（2005DKA21208）；教育部科技基礎(chǔ)條件平臺(tái)（505006）。