覃立立，童 雄，徐 建，張 豪，李加琪，王 翀

(華南農業(yè)大學廣東省農業(yè)動物基因組學與分子育種重點實驗室，廣東廣州 510642）

真核生物基因組中，只有約10% ～15%的基因在單個細胞中表達，因而從mRNA水平上研究差異表達的基因對于從事家畜育種研究工作者是一項非常有意義的工作.Liang等［1］創(chuàng)立了mRNA差異顯示技術(DDRT－PCR)以研究 mRNA的表達差異.李盛霖等［2］利用該技術對福州黑豬、肉用型豬和其他雜種豬的肉質特性進行了研究，結果表明福州黑豬的各項肉質指標均高于各引進肉用型豬種，福州黑豬的肌肉pH為5.24±0.16，肌肉顏色評分為4.33±0.21，肌肉大理石紋評分為3.33±0.21，失水率為(19.28±5.49)%，肌纖維直徑為(43.05±6.12)μm.Lonergan等［3］認為造成豬種生長和肉質性狀差異的原因是高強度選育.李亮等［4］利用mRNA差異顯示技術對絲羽烏骨雞與快大型肉雞肝臟組織中差異表達基因進行篩選，得到10條絲羽烏骨雞與快大型肉雞肝臟差異表達序列標簽.Liu等［5］應用DDRT－PCR技術研究大白、長白正反雜交組合與大白、梅山雜交組合之間背最長肌中基因表達的差異，發(fā)現了一個與CO2水合作用相關的新基因，命名為豬的CA－Ⅲ基因.本研究利用mRNA差異顯示技術對廣東省地方品種藍塘豬和引進品種大白豬達到經濟成熟時的眼肌組織mRNA進行比較.利用DDRT－PCR技術研究中外豬種肉質性狀相關差異表達基因，探討造成中外豬種肉質表型差異的分子機制，對于充分發(fā)揮地方品種和引入品種的遺傳優(yōu)勢、生產出更多滿足人們需要的產品具有重要意義.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 純種藍塘豬眼肌組織樣品采自廣東省板嶺原種豬場，共4頭(公母各半);純種大白豬也來自同一豬場，共4頭(公母各半).采集的2個品種豬均為達到體成熟的健康豬.

1.1.2 差異顯示引物 本研究所用的差異顯示引物由美國Iowa State University的Rothschild教授惠贈，錨定引物序列見表1，隨機引物序列見表2.

表1 差異顯示3′錨定引物序列Tab.1 3′anchor primer sequences of differential display

1.1.3 差異顯示條帶重擴增所用引物 差異顯示條帶回收后重擴增所用引物如表3所示.

1.1.4 主要試劑 TRIZOL Reagent為Invitrogen公司產品.Taq酶、dNTPs、低熔點的瓊脂糖、AMV反轉錄酶、RNasin為 TaKaRa公司產品.DEPC、EDTA、TRIS、TEMED、去離子甲酰胺、過硫酸銨、硼酸、丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、甘油均為上海生物工程有限公司產品.

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA提取 總RNA的提取按照Invitrogen公司的 TRIZOL Reagent使用說明進行.用DNase－I處理以去除其中痕量的染色體DNA污染.

1.2.2 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 差異顯示PCR產物在非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳上分離并拍照.

表2 差異顯示5′隨機引物序列Tab.2 5′random primer sequences of differential display

表3 差異顯示條帶重擴增引物序列Tab.3 Re-amplified primer sequences of differential display bands

1.2.3 銀染顯帶 在銀染的每一步都要戴上干凈的手套，避免在膠板上留下指紋.步驟為凝膠板的分離、固定、凝膠染色、顯影、固定、拍照.

1.2.4 差異顯示條帶回收與重擴增 用潔凈的手術刀片將凝膠上的差異條帶切下，放入0.5 mL的離心管中，加入 50 μL雙蒸水，煮沸 15 min，然后在4℃、8000 r/min離心1 min，吸取上清液，－20℃保存.取上述回收產物1 μL做模板，用與第一次PCR相同的反應體系，分別用T7 promoter和M13rev－48p作為重擴增的上下游引物，進行PCR.PCR反應程序為:94℃變性5 min后，按94℃ 30 s、60℃ 40 s、72℃ 1 min共進行30個循環(huán)，最后72℃延伸5 min.

1.2.5 測序 將差異表達ESTs的PCR產物送交上海英駿生物技術有限公司測序.

2 結果

2.1 差異顯示結果

2.1.1 差異顯示ESTs的重復性 為了便于直觀地顯示出差異表達的條帶，并且保證有差異的條帶具有可重復性，本試驗在電泳時，將2個重復樣品連續(xù)點樣，同一對引物組合4個樣品平行上樣，如圖1所示.其中 ESTsp7在大白豬種中表達量高，而ESTsp8、ESTsp9、ESTsp10、ESTsp11在大白豬中表達量低.差異顯示結果見表4.

圖1 差異顯示PCR聚丙烯酰胺凝膠電泳圖Fig.1 Differential display PCR in polyacrylamide gel electrophoresis

2.1.2 差異顯示ESTs測序結果 本研究得到的差異顯示ESTs測序結果見表5.

2.1.3 差異顯示條帶的重擴增 對差異比較明顯的目的條帶回收后，以回收產物作模板進行PCR，其產物用普通瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到特異性的條帶(圖2).

表4 5條差異顯示的ESTsTab.4 Five differential display ESTss

圖2 差異條帶重擴增電泳圖Fig.2 Differential band re－amplification in gel electrophoresis

表5 ESTs測序結果Tab.5 Sequencing results of ESTs

2.1.4 相似性比對結果 將差異顯示PCR得到的5條ESTs序列與GenBank上已知序列進行對庫檢索，結果表明:ESTsp7序列與細胞色素c氧化酶亞單位Ⅲ基因在473 bp的范圍內相似性達到100%，而ESTsp9、ESTsp10、ESTsp11均與豬 SLN 基因相似性達到了94% ～95%，表明這3段ESTs位于豬SLN基因的不同位置.ESTsp8未搜索到相似基因.

3 討論

Janzen 等［6］利用 DD RT－PCR 的方法鑒定了一個經過選擇純化的品系和一個隨機的對照品系的背最長肌的差異表達基因，分離和鑒定了一條在選擇品系的背最長肌中有很高表達量的590 bp的cDNA，該cDNA與牛的相對分子質量為16000的cAMP－調控磷蛋白(Regulated phosphoprotein，ARPP－16)cDNA序列的3'－非轉錄區(qū)有89%的相似性.對豬的ARPP－16的RT－PCR擴增和測序證實DD法得到的cDNA是豬的 ARPP－16轉錄子的3'末端.半定量PCR分析表明ARPP－16在選擇品系中表達量比對照品系提高了4倍(P＜0.01)，表明 ARPP－16可能是調控豬骨骼肌生長的一個重要的基因.銀巍等［7］應用mRNA差異顯示技術獲得164個在大鼠小腦顆粒神經元凋亡模型中差異表達的ESTs，對其中的17個ESTs進行了克隆并測序，再通過反Northern雜交初步篩選得到 5 個陽性片段.Muráni等［8］用 DDRTPCR技術對胚胎期的皮特蘭和杜洛克骨骼肌轉錄本進行研究，對其中80個cDNA片段測序，43個與生長的時期相關，37個與豬種相關，在得到的85條特異ESTs中，有52條位于已知的基因上.Mario等［9］用DDRT－PCR技術對新生小豬的左右心室的基因表達進行比較，在得到的5600條帶中，有153條被識別的差異顯示條帶.Ponsuksili等［10］為了鑒定可能代表豬胴體性狀候選基因的ESTs，采用DD法對一個資源群體的F2代個體和純種的德國長白豬進行研究，得到了6條差異表達的ESTs，其中的3條與已知基因無任何相似性，另3條與已知基因存在不同程度的相似性.本研究利用200對引物組合篩選到了在藍塘和大白豬種中存在明顯差異表達的5個肌肉組織的ESTs，其中ESTsp7與已知的線粒體基因組編碼的細胞色素c氧化酶亞單位Ⅲ基因高度相似.在線粒體編碼的3個大亞基中，亞基Ⅰ是一種完整的膜蛋白并帶有12個跨膜螺旋(Ⅰ～Ⅻ)，含有3個氧化還原反應中心，并存在于所有的亞鐵血紅素－銅氧化酶中［11］.是否參與氧化呼吸鏈，影響肌肉的熟化代謝過程還有待深入研究.ESTsp9、ESTsp10、ESTsp11與豬SLN基因相似性達到了94% ～95%，表明是該基因的不同區(qū)段.SLN基因在骨骼肌肌漿網快肌纖維中有較高的表達，而在慢肌纖維中表達減少［12］.在心力衰竭的狗的心房中，檢測到SLN蛋白表達水平提高了3倍多，而在心肌缺血的心房中，表達水平減少30%.在受磷蛋白缺失的心房中，SLN蛋白表達量增加，在心房中SLN蛋白代償缺失了的受磷蛋白［13］.研究表明豬SLN基因在豬的背最長肌組織中表達最高，在大梅雜種豬中，背最長肌中該基因的表達量要高于梅山豬［14］.本研究發(fā)現，該基因上的ESTs片段在藍塘豬中表達均高于大白豬，能否作為一個影響中外豬種的產肉機制的候選基因，還需深入研究.

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