李 霞，劉靄珊，徐來祥，趙亞華

(1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510642;2 曲阜師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東曲阜 273165）

哺乳動物防御素具有廣泛的抗性譜，可以抗細菌、真菌、被膜病毒，甚至對支原體、衣原體、螺旋體及腫瘤細胞和愛滋病病毒也有殺傷作用［1-2］.此外，防御素還可啟動獲得性免疫系統(tǒng)，因此越來越受到人們的關(guān)注.哺乳動物的免疫系統(tǒng)包括特異性和非特異性免疫.非特異性免疫對各種入侵機體內(nèi)的微生物在最初反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，哺乳動物防御素(Defensins)是其非特異性免疫的主要成分，存在于多形核粒細胞和上皮組織內(nèi)，如人、大鼠、豚鼠、兔的嗜中性粒細胞及人和小鼠的小腸潘氏細胞內(nèi)［3］.防御素富含Cys，在分子內(nèi)形成二硫鍵，根據(jù)其分子內(nèi)二硫鍵的連接位置不同可分為α-防御素和β-防御素［4］.α-防御素由 29 ～36 個氨基酸(aa)組成，分子內(nèi)含6個保守半胱氨酸形成的3對二硫鍵，連接位點分別為 Cys1-Cys6、Cys2-Cys4 和 Cys3-Cys5［5］.二硫鍵可使小分子防御素分子致密以防蛋白酶水解，致使防御素在吞噬溶酶體環(huán)境中能保持活性.在兔中性粒細胞(Rabbit neutrophil peptide，NP)中分離到6種 α-防御素的陽離子抗菌肽:NP-1、NP-2、NP-3a、NP-3b、NP-4、NP-5，長度均約 32-34 個 aa，富含 Cys和Ary，每種防御素都含3個分子內(nèi)二硫鍵.比對它們的aa組成，其序列高度保守，對其生物學(xué)活性及結(jié)構(gòu)有重要的作用.2003年徐文生等［6］對NP-1進行過原核表達，表達量占細菌總蛋白的34.7%.本研究采用畢赤酵母Pichia pastoris表達系統(tǒng)對pNP-1基因及其串聯(lián)基因進行表達，表達出的多價串聯(lián)體的重組蛋白經(jīng)溴化氰切割，將得到的產(chǎn)物進行抑菌試驗，初步研究兔防御素的抑菌機理.

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

Pichia pastoris GS115菌株、pPICZα-A質(zhì)粒購于Invitrogen公司;常規(guī)克隆宿主菌大腸埃希菌Escherichia coli DH5α，抗菌活性檢測菌株大腸埃希菌K12D31、白色念珠菌Candida albicans、靈菌Serratia macrescens、枯草桿菌Bacillus subtilis、金黃葡萄球菌Staphylococcus aureus及蘇云金桿菌Bacillus thuringiensis均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生化實驗室保存.

1.2 酶與試劑

Taq DNA聚合酶，CIAP堿性磷酸酶，T4DNA連接酶，限制性內(nèi)切酶 EcoRⅠ、SalⅠ、XhoⅠ、SacⅠ 購自大連寶生物工程公司;腸激酶購自NOVAGEN公司;質(zhì)粒小提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司;Zeocin、PVDF超濾膜和ProBond蛋白純化試劑盒購自Invitrogen公司;引物合成及測序由上海英駿生物公司完成;其余試劑均為進口或國產(chǎn)分析純.

1.3 pNP-1基因及其串聯(lián)基因的設(shè)計

根據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛性重編兔防御素基因后的pNP-1基因序列:5'-CGCGAATTCGTCGTCTGTGCTTGTAGAAGAGCTTTGTGTTTGCCAAGAGAAAGAAGAGCTGGTTTCTGTAGAATCAGAGGTAGAATCCACCCATTGTGCTGCAGAAGAGTCGACCGC-3'(下劃線為EcoRⅠ和SalⅠ酶切位點).根據(jù)已調(diào)整的pNP-1序列，使用 Primer Priemir 5.0設(shè)計4條搭橋引物pNP-1(1)、pNP-1(2)、pNP-1(3)和 pNP-1(4)，用于合成pNP-1序列.

利用PCR的方法在pNP-1基因5'端加上XhoⅠ酶切位點及蛋氨酸密碼子ATG，在3'端加上SalⅠ酶切位點，合成pNP-1的串聯(lián)基因［pNP-1(2×)］和［pNP-1(3×)］.引物序列見表1.

表1 引物序列Tab.1 List of primers

1.4 pNP-1基因與其串聯(lián)基因的合成與擴增

1.4.1 pNP-1基因的合成及重組質(zhì)粒 pPICZaA-pNP-1的構(gòu)建 4條搭橋引物作為模板進行PCR，PCR循環(huán)參數(shù):94℃ 2 min，94℃ 30 s、52℃ 30 s、72℃ 40進行25個循環(huán)，72℃ 2 min.取上步產(chǎn)物作為模板，用pNP-1(1)和pNP-1(4)為引物進行第2次PCR擴增，程序為:94℃ 2 min，94℃ 30 s、52℃30 s、72℃ 40 s進行25個循環(huán)，72℃ 10 min.瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化后得到pNP-1基因.

將pNP-1基因與載體pPICZα-A均經(jīng)EcoRⅠ和SalⅠ酶切后回收，連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α.將此克隆的重組質(zhì)粒命名為 pPICZaA-pNP-1.用 AOXⅠ和pNP-1(1)(表1)作為引物進行菌落PCR檢測.

1.4.2 pNP-1串聯(lián)基因的合成 以pPICZα-A-pNP-1重組質(zhì)粒為模板，將pNP-1基因串聯(lián)的正向和反向引物(表1)進行PCR反應(yīng)合成串聯(lián)基因pNP-1(2×)，以此類推得到pNP-1(3×).PCR反應(yīng)程序:94℃ 5 min，94 ℃ 30 s、52 ℃ 30 s、72 ℃ 20 s進行25 個循環(huán)，72℃ 10 min.瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化后得到pNP-1(2×)和pNP-1(3×).

1.4.3 pNP-1多價串聯(lián)重組質(zhì)粒的構(gòu)建 pPICZaA-pNP-1重組質(zhì)粒經(jīng)SacⅠ單酶切消化后CIAP去磷酸化;pNP-1串聯(lián)基因經(jīng)XhoⅠ和SalⅠ雙酶切，連接轉(zhuǎn)化E.coli DH5α.將此雙拷貝重組質(zhì)粒命名為pPICZaA-pNP-1(2×).同樣在 pPICZaA-pNP-1(2×)基礎(chǔ)上構(gòu)建pNP-1三拷貝基因重組質(zhì)粒pPICZaA-pNP-1(3×).

1.5 多倍體酵母重組質(zhì)粒的構(gòu)建

3種重組質(zhì)粒分別經(jīng)SacⅠ酶切線性化.電轉(zhuǎn)畢赤酵母 GS115 感受態(tài)細胞(2.0 kV，25 μF ，200 Ω).30℃培養(yǎng)72 h.重組質(zhì)粒使用AOXⅠ和pNP-1(4)通過菌落PCR鑒定.PCR反應(yīng)程序:94℃ 10 min，(94℃ 30 s，50℃ 30 s，72 ℃ 50 s)30個循環(huán)，72 ℃10 min.產(chǎn)物進行10 g·L－1瓊脂糖凝膠電泳觀察鑒定.

1.6 重組酵母誘導(dǎo)表達后重組蛋白檢測及純化

分別選取生長最旺盛的3種重組酵母菌進行甲醇誘導(dǎo)表達.挑取單菌落接種于BMGY培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)培養(yǎng)72 h后停止，離心收集上清，使用三氯乙酸(TCA)沉淀法初步濃縮上清，Tricine-SDS-PAGE檢測.大量表達重組蛋白使用硫酸銨沉淀法沉淀，取沉淀溶解.將溶解后的樣品使用Sephadex-G25凝膠過濾脫鹽.對于多倍體重組蛋白而言，上述操作后還需進行鎳柱純化.純化樣品經(jīng)Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳檢測.

1.7 單體與多倍體裂解后的蛋白抑菌效價測定

將1.6得到的多倍體重組蛋白使用CNBr進行特異水解，冷凍干燥備用抑菌試驗.

1.7.1 瓊脂擴散法和稀釋法測定抑菌效價 取純化后的單體蛋白和多倍體裂解后樣品，加ddH2O溶解備用.制備指示菌(金黃葡萄球菌，大腸埃希菌K12D31，枯草桿菌，蘇云金桿菌、白色念珠菌、靈菌)菌懸液.配制LB及PDA半固體培養(yǎng)基平板.分別取菌懸液200 μL涂布于相應(yīng)的半固體平板上.待平板完全吸收菌液后，取滅菌的濾紙片放置在平板上，分別浸潤5、10、20和40 μL的樣品，待樣品溶液被平板完全吸收后，放置于37℃培養(yǎng)12 h.觀察抑菌情況.

取瓊脂糖擴散法中菌懸液，10倍倍比稀釋109倍，取5、10、15、20 和25 μL 涂布固體培養(yǎng)基，記錄各板生長的菌落數(shù)，計算出菌液的每毫升單位菌落總數(shù)(CFU/mL).此外，將菌懸液稀釋至105CFU/mL，分別取 50 μL 于 96 孔板，加入樣品液 0、2、4、6、8 和10 μL，再加入無菌水補至10 μL總體積，37℃培養(yǎng)2 h全部取出涂布半固體平板，37℃過夜.計算平板上生長的菌落，算出細菌存活率.

1.7.2 多種抗生素對pNP-1抗金黃葡萄球菌抑菌效價的影響 取氨芐青霉素、鏈霉素、氯霉素、卡那霉素、利福平、新生霉素和四環(huán)素，用上述各抗生素的5倍最低抑菌濃度［6］，對處于對數(shù)生長期(107CFU/mL)的金黃葡萄球菌處理1 h，離心沉淀菌體，用PBS洗凈，并用LB培養(yǎng)基稀釋菌濃度至105CFU/mL，分別取50 μL 稀釋后菌液于96 孔板，加入在菌懸液0、2、4、6、8和10 μL，補水至10 μL總體積，37 ℃培養(yǎng)2 h后測定細菌存活率.以未用抗生素處理的菌體作對照.

2 結(jié)果與分析

2.1 pNP-1單基因的合成

pNP-1單基因的PCR擴增，電泳如圖1所示，第1、2、3泳道均有一條約100 bp的電泳譜帶，與預(yù)期的pNP-1基因大小117 bp相符.

圖1 pNP-1基因的PCR合成Fig.1 PCR amplification of pNP-1 gene

2.2 3種重組質(zhì)粒的PCR鑒定

3種重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5a的單菌落進行菌落PCR，電泳結(jié)果見圖 2.泳道 1、2、3 分別與 pNP-1、pNP-1(2×)和pNP-1(3×)的預(yù)期大小456、556和656 bp相符，說明重組質(zhì)粒中存在有不同拷貝數(shù)的目的片段.

2.3 pNP-1及其重組子重組酵母的菌落PCR鑒定

3個基因轉(zhuǎn)化GS115后長出的酵母單菌落PCR后電泳結(jié)果如圖3.3個基因重組酵母與其重組DH5a的菌落PCR結(jié)果基本一致，說明重組質(zhì)粒已經(jīng)成功整合進入酵母基因組中.

圖2 pNP-1及其多串聯(lián)體重組子轉(zhuǎn)化大腸埃希菌后的菌落PCR鑒定Fig.2 Identification of pNP-1，pNP-1(2 × )and pNP-1(3 × )recombination plasmids by PCR in Escherichia coli

圖3 pNP-1及其多串聯(lián)體重組子轉(zhuǎn)化GS115后的菌落PCR鑒定Fig.3 Identification of pNP-1，pNP-1(2×)and pNP-1(3×)by colony PCR in GS115

2.4 pNP-1重組酵母的甲醇誘導(dǎo)表達

對誘導(dǎo)表達的重組蛋白進行Tricine-SDS-PAGE，結(jié)果見圖4，pNP-1、pNP-1(2×)和 pNP-1(3×)重組蛋白相對分子質(zhì)量(Mr)約與Marker上5000、9000和13000相對應(yīng)，與其重組蛋白的理論Mr5490、9380、13270大小基本相符.

用 Bandscan 5.0軟件計算 pNP-1、pNP-1(2×)和pNP-1(3×)重組蛋白的表達量分別為21.6%、30.7%和41.8%.表達上清液經(jīng)考馬斯亮藍G250法測定總蛋白質(zhì)量濃度分別為15.7、20.8和31.2 mg/L，總體積為100mL.由此得知重組蛋白在發(fā)酵液中的質(zhì)量濃度分別為3.39、6.39和13.05 μg/mL.

圖4 重組酵母的甲醇誘導(dǎo)表達Fig.4 Induced expression of pNP-1，pNP-1(2 × )and pNP-1(3×)by methanol in recombinant GS115

2.5 pNP-1重組蛋白的濃縮與純化

2.5.1 硫酸銨沉淀濃縮重組蛋白 硫酸銨沉淀濃縮后的 pNP-1、pNP-1(2×)和 pNP-1(3×)進行Tricine-SDS-PAGE后結(jié)果如圖5所示.重組蛋白條帶單一，與Marker上Mr約5000、9000和13000的條帶相對應(yīng)，與其重組蛋白的理論值相符.

圖5 硫酸銨沉淀濃縮后的重組蛋白電泳圖Fig.5 Tricine-SDS-PAGE of recombined protein concentrated by ammonium sulfate

2.5.2 pNP-1多倍體重組蛋白的Ni柱純化 pNP-1(2×)和pNP-1(3×)重組蛋白經(jīng)Ni柱純化后電泳結(jié)果如圖6所示，純化后的pNP-1(2×)，pNP-1(3×)重組蛋白基本只剩下Mr為9000和13000的組分，與預(yù)期大小相符.

圖6 純化的pNP-1(2×)和pNP-1(3×)重組蛋白電泳圖Fig.6 Tricine-SDS-PAGE of purified recombinant pNP-1(2 × )and pNP-1(3×)

2.5.3 多倍體重組蛋白的CNBr特異水解 經(jīng)CNBr水解后凍干的pNP-1(2×)和pNP-1(3×)重組蛋白溶于ddH2O，電泳結(jié)果如圖7所示.由圖7可見，出現(xiàn)了Mr約為3800和5000的2條帶.其中Mr約為5000的帶較淺，為帶有表達載體上1600 bp的pNP-1重組蛋白，Mr約為3800的帶為CNBr水解下來的pNP-1蛋白.

圖7 水解［pNP-1(2×)］、［pNP-1(3×)］重組蛋白純化電泳圖Fig.7 Tricine-SDS-PAGE of hydrolyzation of recombined pNP-1(2×)and pNP-1(3×)by cyanogen bromide

2.6 重組pNP-1的抑菌試驗結(jié)果

瓊脂糖擴散法抑菌試驗結(jié)果顯示，pNP-1對蘇云金桿菌、金黃葡萄球菌、枯草桿菌等G+和大腸埃希菌K12D31等G-細菌均有明顯的抑菌作用，而對白色念珠菌沒有抑菌作用，對靈菌有輕微的抑菌作用.取瓊脂糖擴散法試驗中的孢子懸液10倍倍比稀釋后得到的菌液做指示菌存活率試驗，得到的pNP-1質(zhì)量濃度與指示菌存活率關(guān)系如圖8所示，該圖中顯示的結(jié)果與瓊脂糖擴散法抑菌試驗結(jié)果相符合.

圖8 pNP-1質(zhì)量濃度與指示菌存活率的關(guān)系Fig.8 The relationship between pNP-1 mass concentration and survival rate of indicator bacteria

經(jīng)過抑菌數(shù)據(jù)的線性回歸分析，pNP-1對各菌的最小抑菌質(zhì)量濃度分別為金黃葡萄球菌8.59 μg/mL，枯草桿菌 8.13 μg/mL，K12D318.46 μg/mL，蘇云金桿菌 10.63 μg/mL.

2.7 不同抗生素處理對重組pNP-1抑菌活性的影響

將經(jīng)氨芐青霉素、氯霉素、鏈霉素、卡那霉素、新生霉素、四環(huán)素和利福平處理過的金黃葡萄球菌與不同濃度的pNP-1作用，得到7種抗生素對pNP-1抑菌活性影響的數(shù)據(jù)，如表2所示.細胞壁合成抑制劑氨芐青霉素處理后再培養(yǎng)2 h的金黃葡萄球菌的存活率比對照組下降了48.7%，添加了重組pNP-1之后，存活率比對照組平均下降了45.9%，說明pNP-1與氨芐青霉素都對金黃葡萄球菌有抑制作用，兩者之間的抑菌表現(xiàn)出同促效應(yīng).蛋白質(zhì)合成抑制劑卡那霉素、氯霉素、鏈霉素和四環(huán)素處理2 h后的金黃葡萄球菌的存活率分別下降了59%、13%、28%和40.8%，再加入pNP-1處理后存活率均沒有出現(xiàn)顯著的下降，說明多種蛋白質(zhì)合成抑制劑與pNP-1在抑菌方面沒有明顯的關(guān)系.RNA合成抑制劑利福平處理組的數(shù)據(jù)顯示，重組pNP-1對利福平產(chǎn)生同促效應(yīng).DNA合成抑制劑新生霉素處理組，經(jīng)過不同濃度的重組pNP-1處理后，細菌存活率最大下降值為6.5%，與對照組相比其下降幅度較小.2種核酸合成抑制劑對重組pNP-1表現(xiàn)不同的效應(yīng).

表2 不同抗生素處理過的金黃葡萄球菌在不同質(zhì)量濃度重組pNP-1蛋白下的存活率Tab.2 Survival rates of different antibiotic-treated Staphylococcus aureus under different mass concentrations of recombinant pNP-1 protein %

3 討論

圍繞兔防御素基因的表達，本研究實施了一系列有利于該基因表達的策略.目的基因中含過多的稀有密碼子被認為是低表達水平和產(chǎn)生不完全產(chǎn)物的一個原因［7-8］.盡管少量稀有密碼子的出現(xiàn)通常不會給目的蛋白的合成造成太大影響，但如果一個基因中含有成串或多個稀有密碼子，外源蛋白的表達水平將非常低.當在氨基端附近出現(xiàn)多個稀有密碼子時，情況更為嚴重［9］.根據(jù)畢赤酵母表達偏愛性優(yōu)化最適合表達的pNP-1基因，設(shè)計引物人工搭橋合成，使用同尾酶構(gòu)建多串聯(lián)體在畢赤酵母中表達，明顯提高了重組蛋白的表達量.1996年Lee等［10］為擴大NP-1基因的表達量，嘗試使用E.coli表達各種的融合串聯(lián)多肽，這一方法使多肽的表達有顯著提高，但表達量的增加并未與串聯(lián)數(shù)的增長成正相關(guān)，特別是當串聯(lián)數(shù)較大時，串聯(lián)體的表達量反而降低.

限于試驗條件，本研究對于pNP-1在畢赤酵母系統(tǒng)中的表達的所有數(shù)據(jù)都由搖瓶發(fā)酵獲得，而培養(yǎng)溫度、通氣量、培養(yǎng)基酸堿度、培養(yǎng)密度等培養(yǎng)條件對表達量均有重要的影響，這些因素只有在發(fā)酵罐發(fā)酵的條件下才能得到嚴格控制，因此pNP-1基因的畢赤酵母發(fā)酵表達的過程仍有待進一步的優(yōu)化.

很多研究都表明其作用位點不局限于只對細菌的膜結(jié)構(gòu)，而更多是參與抑制細菌中核酸和蛋白合成的過程［11-14］.同時，也有研究［15-16］表明，防御素對細菌細胞膜的作用只是其整個抑菌過程的第1步，通過在細菌膜上形成穿孔或增加膜的通透性使其更容易進入細胞內(nèi)部，并與細胞內(nèi)的其他作用位點相互作用而進一步抑制細菌的生長.不同的抗生素有其特異的作用位點，對于防御素的作用機制，這也在本試驗中有所體現(xiàn)，但其具體作用機制還有待進一步研究.

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