陶玉貴 王其進 黃曉東 谷 浩 倪 正

(安徽工程大學生物與化學工程學院/安徽省微生物發(fā)酵工程技術研究中心，蕪湖，241000)

膠束電動毛細管色譜法測定水中的毒死蜱含量*

陶玉貴＊＊王其進 黃曉東 谷 浩 倪 正

(安徽工程大學生物與化學工程學院/安徽省微生物發(fā)酵工程技術研究中心，蕪湖，241000)

利用膠束電動毛細管色譜(MEKC)建立了測定水中毒死蜱含量的方法，研究了檢測波長、運行緩沖液的種類、濃度以及pH、有機添加劑、脫氧膽酸鈉(NaDCh)的濃度和分離電壓等實驗條件對毒死蜱測定的影響.實驗結果表明，以 25 mmol·L－1硼砂(pH 9.0，含 20%(V/V)乙腈和 50 mmol·L－1NaDCh)作為緩沖溶液，毒死蜱能在15 min內(nèi)實現(xiàn)很好的基線分離，線性范圍為15.63—500 mg·L－1，線性相關系數(shù)為0.9998，檢出限(以信噪比(S/N=3)計)為0.135 mg·L－1，加標回收率為98.91%—100.9%.精密度和穩(wěn)定性實驗中，峰面積和遷移時間的相對標準偏差均小于3%，表明重復性良好.

毛細管電泳，膠束電動毛細管色譜，毒死蜱，水，測定.

O，O-二乙基-O-(3，5，6-三氯-2-吡啶基)硫代磷酸酯是一種廣泛應用于谷物、水果、蔬菜、茶等農(nóng)作物的中等毒性內(nèi)吸性有機磷殺蟲劑［1］，商品名稱為毒死蜱(chlorpyrifos).毒死蜱能通過抑制體內(nèi)神經(jīng)病靶酯酶，并使之“老化”，從而引起遲發(fā)性神經(jīng)病、新生嬰兒免疫功能缺陷［2］和癌癥［3］;此外，毒死蜱在土壤中的降解半衰期高達278 d［4］，毒死蜱在環(huán)境中的殘留會污染土壤、地表水和地下水，最終對環(huán)境生物和人體健康產(chǎn)生影響.

目前，國內(nèi)外報道的檢測毒死蜱的方法主要有氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)等［5-8］.而近幾年，高效毛細管電泳(HPCE)以其高效、快速、低消耗的特點而越來越被人們關注，并廣泛地用于農(nóng)藥殘留的檢測.膠束電動毛細管色譜法(MEKC)是在緩沖溶液中加入表面活性劑，當其濃度達到或超過臨界膠束濃度時就會產(chǎn)生膠束(準固定相)，利用溶質(zhì)不同的疏水性，在水相和膠束相間的分配行為不同，使混合組分得以分離，膠束電動毛細管色譜法既可分析帶電物質(zhì)又可分析中性物質(zhì)，獨特的優(yōu)勢使其在農(nóng)藥和天然產(chǎn)物分析中得到了廣泛的應用［9-11］.膽酸鹽是一類生物表面活性劑，有研究表明膽酸鹽可以形成螺旋狀的膠束，疏水端水溶液緊密接觸，與十二烷基硫酸鈉(SDS)膠束相比較，它更能適應高濃度的有機溶劑，而且形成的聚集體相比烷基鏈表面活性劑更具有極性［12］.

本文利用毛細管電泳技術，在檢測樣品中通過添加脫氧膽酸鈉(NaDCh)進行增溶，使毒死蜱在水相和膠束相之間因分配系數(shù)不同而得到分離，從而達到檢測水中毒死蜱的含量.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Beckman P/ACE MDQ毛細管電泳儀，配備二極管陣列檢測器;未涂層石英毛細管:36 cm×75 μm(美國 Beckman Coulter).實驗中所有數(shù)據(jù)采集和計算用32Karat softwareV4.0軟件(美國 Beckman Coulter).PH-510型精密酸度計(上海雷磁儀器廠).Sartorius公司萬分之一天平;ELGA公司超純水儀;湖南省凱達實業(yè)發(fā)展有限公司TD5Z臺式離心機.

毒死蜱標準品(北京上立方聯(lián)合化工技術研究院);硼砂、脫氧膽酸鈉(NaDCh)、甲醇、乙腈等均為分析純;實驗所用水均為二次蒸餾水.

1.2 標準品溶液和樣品溶液的制備

標準品溶液:精確稱取毒死蜱標準品10 mg，用10 mL乙腈溶解，即得質(zhì)量濃度為1000 μg·mL－1的標準品溶液，置于4℃冰箱中保存，使用時稀釋成各種濃度的標準溶液.

樣品溶液的制備:將水樣離心，取20 mL的離心上清液，倒入250 mL的分液漏斗中，加入2—3 g氯化鈉，分別用40、30、30 mL二氯甲烷萃取，待靜止分層后，將下層有機相經(jīng)無水硫酸鈉脫水，合并萃取液.吸取20 mL二氯甲烷溶液于150 mL燒杯中，加入0.5 mL乙酸乙酯，將燒杯放在65℃水浴鍋上加熱，杯內(nèi)緩緩通入氮氣流，濃縮萃取物至近干，用乙腈定容至5 mL［13］.經(jīng)0.45 μm有機膜過濾，濾液備用.

1.3 電泳條件

電泳運行緩沖液為25 mmol·L－1硼砂溶液，含 20%(V/V，下同)乙腈和 50 mmol·L－1脫氧膽酸鈉，pH值為9.0;紫外檢測波長為293 nm;分離電壓為25 kV;壓力:0.5 psi;進樣時間:5 s;溫度:25℃.毛細管柱在每次使用前依次用二次蒸餾水、0.1 mol·L－1NaOH、二次蒸餾水分別預洗2 min，再用緩沖液洗5 min.樣品采用壓力進樣，紫外檢測.所有溶液在進入毛細管分離柱前，均用0.45 μm微孔濾膜過濾.重復進樣時只用緩沖溶液沖洗2 min，更換不同緩沖溶液時按上述步驟重新處理.

2 結果與討論

2.1 電泳條件的選擇

2.1.1 檢測波長的選擇

利用二極管陣列檢測器對毒死蜱標樣進行全波長掃描(190—300 nm).確定293 nm作為檢測波長，此時有較大的吸收峰，且基線平穩(wěn).

2.1.2 緩沖液種類、濃度和pH值的選擇

采用了不同 pH 值(6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)的 NaH2PO4-Na2HPO4緩沖體系進行電泳，結果表明在 pH值為9.0時，電泳效果最好.考察了幾種pH值范圍在9.0不同的緩沖體系(硼砂緩沖體系、Tris-HCl緩沖體系)，結果表明Tris-HCl體系背景噪音較大，硼砂緩沖體系峰形較好，噪音小，因此選用硼砂緩沖體系.

進一步考察了硼砂的濃度為10—35 mmol·L－1時對分離度和分離電流的影響.結果表明，隨著硼砂濃度的提高，在其它條件保持不變的情況下，毒死蜱的遷移時間延遲，如圖1所示.出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能的原因是MEKC膠束毛細管電泳的分離原理可以看作是以電滲流作驅(qū)動力的液-液分配色譜，隨著緩沖溶液中離子強度的增加，溶液的導電性增強，電流增加，同時由于緩沖溶液中陽離子濃度的增加，導致zeta電勢降低，雙電子層變薄，電滲流下降.由圖1可以看出，當緩沖溶液的濃度達到25 mmol·L－1時，峰高值最大，且峰形窄，分離效果較好.考慮到檢測時間和峰分離度，選擇25 mmol·L－1作為實驗濃度.

緩沖體系pH值是影響分離度的重要因素之一.在硼砂緩沖液濃度為25 mmol·L－1時，對pH值從8.6至9.6每隔0.2個單位進行考察，結果如圖2所示.圖2可見，隨著pH值的增高，出峰時間逐漸提前.一定程度上，峰高值越大，分離效果越好，當緩沖體系pH為9.0時，峰高值最大，而且峰形最好且基線穩(wěn)定.綜合以上因素，本文選擇pH為9.0的硼砂緩沖體系.

圖1 緩沖液濃度對毒死蜱峰高和遷移時間的影響Fig.1 Effect of buffer concentration on migration time and peak height of chlorpyrifos

圖2 硼砂緩沖體系pH對毒死蜱遷移時間和峰高的影響Fig.2 Effect of borax buffer pH on migration time and peak height of chlorpyrifos

2.1.3 有機添加劑對分離檢測的影響

在使用MEKC進行電泳分離的過程中，在緩沖溶液中添加有機改性劑，通過改變緩沖體系中水相的特性，從而影響了膠束的結構，同時也增加了流動相對分析物的溶解度，以達到調(diào)節(jié)選擇性、改進分離度的目的.但高濃度的有機添加劑又會造成緩沖液中鹽的析出以及阻礙膠束的形成.實驗中考察了甲醇、乙腈及其不同含量時對分離效果的影響.結果表明，以乙腈為有機添加劑時的目標峰較高(圖3)，有利于分析檢測的靈敏度，所以本文選擇乙腈作為有機添加劑.進一步考察了乙腈含量對分離的影響.隨著乙腈添加比例的增加，目標物的遷移時間逐漸延長;乙腈含量為20%(V/V)時，目標峰的檢測靈敏度達到最大，故本文選擇20%的乙腈作為有機添加劑進行下一步條件的優(yōu)化.

2.1.4 NaDCh 濃度的選擇

在MEKC中，采用脫氧膽酸鈉(NaDCh)膠束體系常常是一種有效的方法.當緩沖溶液中的NaDCh濃度超過其臨界膠束濃度時，則分子締合形成膠束.考察在25 mmol·L－1硼砂緩沖液(pH值為9.0)中，添加不同濃度 NaDCh(10、15、20、20、30、35、40、45、50、55、60 mmol·L－1)對分離效果的影響(圖4).結果表明，隨著NaDCh濃度的增加，膠束作用增強，目標峰遷移時間逐漸延長，峰高在NaDCh濃度為20 mmol·L－1時出現(xiàn)拐點后先增大后降低.當NaDCh濃度為50 mmol·L－1時，目標物的峰高達到最大，峰形最好.綜合分析，本文選擇NaDCh濃度為50 mmol·L－1.

圖3 有機添加劑對毒死蜱峰高和遷移時間的影響Fig.3 Effect of organic additives on peak height and migration time of chlorpyrifos

圖4 NaDCh濃度對毒死蜱遷移時間和峰高的影響Fig.4 Effect of NaDCh concentration on migration time and peak height of chlorpyrifos

2.1.5 分離電壓的選擇

在 pH 為9.5，20 mmol·L－1的硼砂緩沖液，NaDCh 濃度為50 mmol·L－1的電泳條件下，考察了外加分離電壓(13、16、19、22、25、28 kV)對溶質(zhì)分離效果的影響.結果表明，隨著分離電壓的增大，焦耳熱逐漸增大，進而使背景噪聲增加;同時分離電壓的增加又會導致遷移時間也逐漸減小，這又有利于樣品的快速分析.綜合考慮，本文選定25 kV作為電泳分離電壓.

2.1.6 分離溫度的選擇

電泳溫度的選擇，主要是指毛細管外表溫度的選擇和控制.溫度變化不僅影響分離的重現(xiàn)性，而且影響分離效率.本實驗考察了18℃—30℃的影響，結果表明，溫度越高，樣品的分離效率越高，但重現(xiàn)性隨之變差，綜合考慮，選擇電泳溫度為25℃.

2.2 線性關系與檢測限

吸取毒死蜱標準品溶液并用乙腈分別稀釋至 500、250、125、62.5、31.25、15.625 mg·L－1的系列質(zhì)量濃度，經(jīng)1.3電泳條件測定后，以毒死蜱濃度(x)為橫坐標，峰面積(y)為縱坐標，作標準曲線，得到線性回歸方程為 y=467.25x+4691，標準曲線在15.625—500 mg·L－1濃度范圍內(nèi)線性關系良好，r=0.9998.以信噪比為3時，確定該毛細管電泳條件下的檢測限為0.135 mg·L－1.

2.3 精密度試驗

取樣品溶液1份，在優(yōu)化的電泳條件下測定，重復進樣5次.峰面積的相對標準偏差(RSD)為1.9%，遷移時間的RSD為0.06%，表明在此條件下，進樣精密度良好.

2.4 加標回收率試驗

準確量取一定量已知毒死蜱含量的樣品溶液，將樣品溶液分成3組，每組3份，分別加入3種不同量的毒死蜱標準品，按照最優(yōu)化條件進行測定，結果如表1所示.樣品的添加平均回收率為98.91%—100.9%，表明該方法正確可靠.

表1 水樣中毒死蜱的添加回收率Table 1 Fortified recovery rate of chlorpyrifos in water

2.5 樣品測定

用本方法對污染嚴重的10塊農(nóng)田地表水進行測定，均檢出毒死蜱，含量范圍1.50—20.36 mg·L－1.在優(yōu)化的電泳條件下毒死蜱標準品和水樣的電泳圖譜見圖5.

圖5 毒死蜱標準品(200 mg·L－1)和水樣的膠束電動毛細管色譜圖Fig.5 MEKC electropherograms of chlorpyrifos standard solution(200 mg·L －1)and water sample

3 結論

通過優(yōu)化測定條件，建立了一種基于膠束電動毛細管色譜法檢測水中毒死蜱的方法.該方法通過向緩沖液中加入脫氧膽酸鈉和乙腈，解決了毒死蜱易吸附于毛細管管壁而無法檢測的問題，適用于水中毒死蜱的定量分析.

［1］Jack D Thrashere，Gunnar Heuser，Alan B.Immunological abnormalities in human chronically exposed to chlorpyrifos［J］.Archives of Environmental Health，2002，57(3):181-187

［2］Galloway T，Handy R.Immunotoxicity of organophosphorous pesticides［J］.Ecotoxicology，2003，12:345-363

［3］Won J L，Aaron B，Jane A H，et al.Cancer incidence among pesticide applicators exposed to chlorpyrifos in the agricultural health study［J］.Journal of the National Cancer Institute，2004，96(23):1781-1789

［4］Yucel U，Ylim M，Gozek K，et al.Chlorpyrifos degradation in Turkish soil［J］.J Environ Sci and Health，1999，34(1):75-95

［5］凌云，王菡，雍煒，等.氣相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法檢測蔬菜中的毒死蜱及其代謝物［J］.色譜，2009，27(1):78-81

［6］張超，楊紅.水、土壤和蔬菜中毒死蜱、甲基毒死蜱殘留檢測前處理方法［J］.農(nóng)藥，2010，49(5):367-370

［7］韓暢，朱魯生，王軍，等.HPLC測定水體中毒死蜱及其有毒降解產(chǎn)物TCP［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報，2009，28(7):1552-1556

［8］管宏云，黃曉璐.高效液相色譜法測定廢水中的辛硫磷、毒死蜱［J］.污染防治技術，2009，22(4):87-88

［9］張良，許楊，李燕萍.膠束電動毛細管色譜法檢測紅曲米中的莫納可林K［J］.色譜，2010，28(4):393-396

［10］靳淑萍，李萍，董樹清，等.毛細管電泳-電化學檢測法測定黃芪及其制劑中的活性成分［J］.色譜，2009，27(2):229-232

［11］陶玉貴，汪耀明，葉連斌，等.水中甲胺磷的毛細管膠束電動色譜測定法［J］.環(huán)境與健康雜志，2008，25(3):250-252

［12］Agmlar M，F(xiàn)arran A，Serra C，et al.Use of different surfactants(sodium dodecyl sulfate，bile salts and ionic polymers)in micellar electrokinetic capillary chromatography application to the separation of organophosphorus pesticides［J］.Journal of Chromatography A，1997，778:201-205

［13］Song S L，Ma X D，Li C J.Multi-residue determination method of pesticides in leek by gel permeation chromatography and solid phase extraction followed by gas chromatography with mass spectrometric detector［J］.Food Control，2007，18(5):448-453

DETERMINATION OF CHLORPYRIFOS IN WATER BY MICELLAR ELECTROKINETIC CAPILLARY CHROMATOGRAPHY

TAO Yugui WANG Qijin HUANG Xiaodong GU Hao NI Zheng
(Department of Biochemical Engineering，Anhui Polytechnic University/Engineering Technology Research Center of Microbial Fermentation，Wuhu，241000，China)

A method for chlorpyrifos determination in water based on micellar electrokinetic capillary chromatography had been developed.The assay conditions including detection wavelength，pH and the concentrations of running buffer，organic additive，the concentrations of sodium deoxycholate(NaDCh)，and the separation voltage were optimized.Under the optimized conditions(25 mmol·L－1borate buffer(pH 9，containing 20%(V/V)acetonitrile，50 mmol·L－1NaDCh)，chlorpyrifos was separated within 15 min，with a linear range of 15.63—500 mg·L－1(r2=0.9998)and a limit of detection(S/N=3)of 0.135 mg·L－1.It had good recoveries(98.91%—100.9%)and low relative standard deviations(below 3%).

capillary electrophoresis(CE)，micellar electrokinetic capillary chromatography(MEKC)，chlorpyrifos，water，determination.

2010年12月19日收稿.

*安徽省科技攻關計劃面上項目(08010302169)資助.

＊＊通訊聯(lián)系人，Tel:0553-2871254;E-mail:taoyugui888@yahoo.com.cn