許文武 孟 菁 胡 威 章 典 張庭廷＊＊

(1.安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物環(huán)境與生態(tài)安全安徽省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蕪湖，241000;2.安徽師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)學(xué)院，蕪湖，241000)

5種酚類化合物對3種水生生物的毒性作用*

許文武1孟 菁2胡 威1章 典1張庭廷1＊＊

(1.安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物環(huán)境與生態(tài)安全安徽省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蕪湖，241000;2.安徽師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)學(xué)院，蕪湖，241000)

通過測定藻細(xì)胞密度和溞數(shù)量的變化，研究了5種酚類化合物對蛋白核小球藻 (Chlorella pyrenoidosa)、斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)和多刺裸腹溞(Moina macrocopa)3種水生生物的影響.結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)第6天，隨酚類化合物濃度增加，藻細(xì)胞密度與對照組相比明顯下降，多刺裸腹溞48 h死亡率增高，呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系.對苯二酚、間苯二酚、2，4-二氯酚、2，4-二硝基酚和2，4，6-三硝基酚5種酚類化合物在第6 天對蛋白核小球藻的半抑制效應(yīng)濃度(ErC50)值依次為:7.73 、25.21、33.19、38.51 和 25.08 mg·L－1;對斜生柵藻依次為:9.13、30.28、40.77、48.09 和 16.09 mg·L－1;在 48 h，對苯二酚、間苯二酚、2，4-二氯苯酚、2，4-二硝基酚和 2，4，6-三硝基酚對多次裸腹溞的半致死效應(yīng)濃度(LC50)值分別為:1.92、10.75、15.53、15.68和9.87 mg·L－1.5種酚類化合物對3種水生生物的毒性研究表明，對苯二酚的毒性最強(qiáng)，2，4-二硝基酚的毒性最弱.

水生生物，酚類化合物，急性毒性.

酚類有機(jī)污染物是一種中等強(qiáng)度的化學(xué)毒物，能夠引起蛋白質(zhì)變性，使細(xì)胞中毒或死亡［1］.許多工廠如煤氣、焦化、煉油、冶金、石油化工、造紙、醫(yī)藥、農(nóng)藥等排放的廢水中均含有酚類化合物.這些廢水若不經(jīng)過處理直接排放，或者雖經(jīng)處理但未能達(dá)到排放標(biāo)準(zhǔn)，就會造成水、土壤和大氣環(huán)境污染，危害生態(tài)環(huán)境和人體健康.

在探討酚類化合物的毒性以及預(yù)測該類化合物的毒性大小的試驗(yàn)中，常采用綠藻或大型水溞作為指示生物.綠藻類是水生生態(tài)系統(tǒng)中的初級生產(chǎn)者，也是水生食物鏈的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)，其種類多樣并直接影響水生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能［2-3］，是較為理想的化學(xué)物質(zhì)測試生物［4］.同樣，溞類是水體中初級生產(chǎn)者(藻類)和消費(fèi)者(如魚類)間的中間環(huán)節(jié)，其繁殖速度快，生活周期短，培養(yǎng)簡便，對許多毒物敏感，世界各國廣泛使用溞類進(jìn)行水生生態(tài)毒理學(xué)研究［5-6］.由于酚類化合物導(dǎo)致的水體污染必然危及水生生物，因此通過酚類化合物對綠藻、溞毒性的研究，探討酚類化合物對水生生態(tài)系統(tǒng)的影響［7-8］有著重要的意義.

本文選取毒性試驗(yàn)中常用的斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)，蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)和多刺裸腹溞(Moina macrocopa)作為受試對象，研究了酚類化合物對3種水生生物的毒性效應(yīng)，為制定酚類化合物相關(guān)的環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù).

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

對苯二酚、間苯二酚、2，4-二氯苯酚、2，4-二硝基酚、2，4，6-三硝基酚，購自國藥集團(tuán)化學(xué)有限公司.

蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa Chick)和斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)購自中國科學(xué)院水生生物研究所.兩種藻均用HB-4培養(yǎng)基培養(yǎng).

多刺裸腹溞(Moina macrocopa)由日本長崎大學(xué)提供.

1.2 實(shí)驗(yàn)用液的制備

HB-4 培養(yǎng)基主要成分:(NH4)2SO4，0.2 g·L－1;K2HPO4，0.015 g·L－1;CaCl2，0.015 g·L－1;MgSO4·7H2O，0.08 g·L－1;NaHCO3，0.1 g·L－1;KCl，0.025 g·L－1;FeCl3，0.15 mL·L－1;土壤浸提液，2 mg·L－1.

土壤浸提液的制備:采取未施肥土500 g，加蒸餾水1000 mL后攪勻，浸泡1 d，100℃水浴鍋加熱2 h.上清液過濾，滅菌，冷藏，保存.

1.3 培養(yǎng)方法

實(shí)驗(yàn)前一周，蛋白核小球藻和斜生柵藻于培養(yǎng)箱中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:溫度(24±2)℃，光照強(qiáng)度4000 lx，光暗比12 h∶12 h，每天搖動(dòng)培養(yǎng)瓶3—5次，使藻類生長進(jìn)入對數(shù)生長期.

多刺裸腹溞在培養(yǎng)箱內(nèi)((24±2)℃)，光暗比為12 h∶12 h，光強(qiáng)為4000 lx條件下進(jìn)行培養(yǎng).所用培養(yǎng)液為曝氣自來水，每2—3 d更換1次，每天喂養(yǎng)1次斜生柵藻濃縮懸浮藻液，斜生柵藻的投喂密度為1.0 ×106cells·mL－1［9］，藻液的顏色為淡蘋果綠色.實(shí)驗(yàn)前把懷卵量多的雌溞用玻璃吸管吸出，用100 mL小燒杯分開單個(gè)喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)材料為1日齡幼溞.

1.4 酚類化合物對蛋白核小球藻和斜生柵藻的毒性作用

HB-4培養(yǎng)基配制5種酚類化合物母液，再根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定5種酚類化合物對蛋白核小球藻的急性毒性試驗(yàn)的濃度范圍，一定量的培養(yǎng)基稀釋，現(xiàn)用現(xiàn)配.取對數(shù)生長期的蛋白核小球藻和斜生柵藻分別加入100 mL的錐形瓶中，再加入稀釋的毒物到所需濃度，使各藻類的起始密度為6×105cells·mL－1左右，每組3個(gè)平行，另各設(shè)一個(gè)空白對照即只含對應(yīng)的培養(yǎng)基和相同濃度的藻液，將藻液放入1.2所述條件下進(jìn)行培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)周期為6 d，每隔48 h取藻液采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù).

1.5 酚類化合物對多刺裸腹溞的毒性作用

多刺裸腹溞以10個(gè)為一組，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果分別設(shè)定毒物的濃度，同時(shí)設(shè)1個(gè)空白對照組，每組3個(gè)平行，培養(yǎng)48 h，期間不投喂食物，每隔24 h觀察記錄每個(gè)燒杯中多刺裸腹溞的死亡數(shù)目(多刺裸腹溞死亡標(biāo)準(zhǔn)為旋轉(zhuǎn)燒杯觀察沉到杯底部的多刺裸腹溞在1—2 min內(nèi)不能游動(dòng)視為死亡［10-11］).

1.6 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS V17.0軟件包進(jìn)行獨(dú)立樣本檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05為顯著性差異.

酚類化合物對兩種藻類的平均比生長速率(μ)計(jì)算公式為:μ=lnNn－lnN1/(tn－t1);式中:N1為t1時(shí)的藻細(xì)胞數(shù)，Nn為 tn時(shí)的藻細(xì)胞數(shù).抑制率(%)=(μ對照組－ μ處理組)/μ對照組×100%.根據(jù)抑制率(y)與相應(yīng)的濃度對數(shù)(x)，用直線回歸法得到濃度效應(yīng)方程:y=b×x+a.當(dāng)抑制率為50%時(shí)，得到的濃度對數(shù)取反對數(shù)即為所求半抑制效應(yīng)濃度(ErC50)［12-13］.

酚類化合物對多刺裸腹溞抑制率(IR)的計(jì)算公式為:IR(%)=(1－N/N0)×100%;其中，N為多刺裸腹溞個(gè)數(shù);N0為空白對照組多刺裸腹溞個(gè)數(shù).將死亡率換算成概率單位.根據(jù)酚類化合物質(zhì)量濃度對數(shù)與抑制率的概率單位作一元線性回歸方程:y=b×x+a，抑制率的概率單位為5時(shí)，得到的濃度對數(shù)取反對數(shù)即為所求半致死效應(yīng)濃度LC50，再計(jì)算出LC50的95%置信限.

2 結(jié)果與討論

2.1 5種不同濃度的酚類化合物對蛋白核小球藻生長的影響

5種酚類化合物對蛋白核小球藻的急性毒性結(jié)果如圖1，由圖1可見，蛋白核小球藻對照組在實(shí)驗(yàn)期內(nèi)藻細(xì)胞個(gè)數(shù)持續(xù)上升，而實(shí)驗(yàn)組中除間苯二酚處理后的第2天藻液密度大于對照組密度外，其余各組均隨著酚類化合物濃度的增加，藻的生長抑制作用增強(qiáng).

蛋白核小球藻的生長抑制率(y)按實(shí)驗(yàn)第6天的結(jié)果計(jì)算，將抑制率與濃度(x)進(jìn)行線性相關(guān)分析，結(jié)果列于表1，由表1可知，5種酚類化合物對蛋白核小球藻急性毒性結(jié)果的各方程相關(guān)系數(shù)大于0.9，P＜0.05，具有良好相關(guān)性，表明本實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可信.根據(jù)各相關(guān)方程求得對苯二酚、間苯二酚、2，4-二氯苯酚、2，4-二硝基酚和 2，4，6-三硝基酚對蛋白核小球藻的 ErC50分別為 7.73 、25.21、33.19、38.51和25.08 mg·L－1.根據(jù)國家環(huán)境保護(hù)總局《新化學(xué)物質(zhì)危害評估導(dǎo)則》(HJ/T 154—2004)中的分級標(biāo)準(zhǔn)［14］，對苯二酚對蛋白核小球藻屬高毒，其余4種酚類化合物均屬中毒，毒性大小依次為:對苯二酚 ＞2，4，6-三硝基酚 ＞ 間苯二酚 ＞2，4-二氯苯酚 ＞2，4-二硝基酚.

圖1 5種酚類化合物(mg·L－1)對蛋白核小球藻細(xì)胞密度的影響Fig.1 The effect of five phenol compounds(mg·L －1)on Chlorella pyrenoidosa Chick

表1 5種酚類化合物作用于蛋白核小球藻的ErC50以及回歸方程(第6天)Table 1 ErC50and regression equations for five phenol compounds on Chlorella pyrenoidosa Chick(the sixth day)

2.2 5種不同濃度的酚類化合物對斜生柵藻生長的影響

5種酚類化合物對斜生柵藻的急性毒性試驗(yàn)見圖2，由圖2可見，5種酚類化合物對斜生柵藻的毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果和對蛋白核小球藻一致，即低濃度時(shí)抑制不明顯，隨著處理濃度的增大，抑制作用明顯加劇.

斜生柵藻的生長抑制率同樣按第6天的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行計(jì)算，將抑制率與濃度(x)進(jìn)行線性相關(guān)分析，方程如表2，由表2可知，各方程相關(guān)系數(shù)大于0.9，P＜0.05，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠.對苯二酚、間苯二酚、2，4-二氯苯酚、2，4-二硝基酚和 2，4，6-三硝基酚對斜生柵藻的 ErC50分別為 9.13、30.28、40.77、48.09 和16.09 mg·L－1.根據(jù)國家環(huán)境保護(hù)總局《新化學(xué)物質(zhì)危害評估導(dǎo)則》(HJ/T 154—2004)中的分級標(biāo)準(zhǔn)［14］，對苯二酚對斜生柵藻表現(xiàn)出的毒性屬高毒，其余4種酚類化合物均屬中毒，且毒性大小依次為:對苯二酚 ＞2，4，6-三硝基酚 ＞ 間苯二酚 ＞2，4-二氯苯酚 ＞2，4-二硝基酚.

圖2 5種酚類化合物(mg·L－1)對斜生柵藻細(xì)胞密度的影響Fig.2 The effect of five phenol compounds(mg·L －1)on Scenedesmus obliquus

表2 5種酚類化合物作用于斜生柵藻的ErC50以及回歸方程(第6天)Table 2 ErC50and regression equations for five phenol compounds on Scenedesmus obliquus(the sixth day)

2.3 5種不同濃度的酚類化合物對多刺裸腹溞的影響

5種酚類化合物對多刺裸腹溞的毒性作用見表3.由表3中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)求出各時(shí)間內(nèi)濃度與概率單位的回歸方程以及LC50的95%置信限(表4).由表4可以看出，根據(jù)國家環(huán)境保護(hù)總局《新化學(xué)物質(zhì)危害評估導(dǎo)則》(HJ/T 154—2004)中的分級標(biāo)準(zhǔn)［14］，5種酚類化合物對多刺裸腹溞有不同的毒性作用，其中(在24 h或48 h)對苯二酚對水溞表現(xiàn)為高毒，其余的4種酚類化合物表現(xiàn)為中毒.在48 h時(shí)，5種酚類化合物對多刺裸腹溞的毒性大小依次為:對苯二酚＞2，4，6-三硝基酚＞間苯二酚 ＞2，4-二氯苯酚＞2，4-二硝基酚.

表3 5種酚類化合物對多刺裸腹溞的毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 The toxicity experiment results of the five phenol compounds

表4 毒性試驗(yàn)的回歸方程、LC50值(mg·L－1)和95%置信限Table 4 Regression equation，LC50values(mg·L －1)and 95%confidence limits of toxicity

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明5種酚類化合物對水生生物具有一定的毒性.已有研究表明，中毒時(shí)間越長，產(chǎn)生半數(shù)致毒效應(yīng)所需的濃度越低，即LC50或ErC50值越低［15］，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)5種酚類化合物對多刺裸腹溞的研究也符合此種情況.

有研究認(rèn)為酚類化合物透過生物膜進(jìn)入生物體內(nèi)與生物體內(nèi)的作用位點(diǎn)發(fā)生反應(yīng)［12］.Baziramakenga等指出多酚類物質(zhì)能夠降低礦物質(zhì)和水分的吸收而抑制植物的生長［16］.根據(jù)本次試驗(yàn)結(jié)果，2，4，6-三硝基酚對生物的毒性大于2，4-二硝基酚，即隨著硝基取代基的增加，硝基苯類物質(zhì)毒性越大，這與王宏等［17］研究結(jié)果一致.若將ErC50或LC50值的十分之一作為安全濃度［15］，則對苯二酚、間苯二酚、2，4-二氯苯酚、2，4-二硝基酚和 2，4，6-三硝基酚對蛋白核小球藻安全濃度分別為 0.773、2.521、3.319、3.851 和 2.508 mg·L－1;對斜生柵藻安全濃度分別為 0.913、3.028、4.077、4.809 和1.609 mg·L－1;對多刺裸腹溞安全濃度分別為 0.192、1.075、1.553、1.568 和 0.987 mg·L－1，可取其中的最低值(對苯二酚為 0.192 mg·L－1、間苯二酚為1.075 mg·L－1、2，4-二氯苯酚為 1.553 mg·L－1、2，4-二硝基酚為1.568 mg·L－1和2，4，6-三硝基酚為0.987 mg·L－1)作為 5 種酚類化合物對水中浮游生物的安全閾值.

因此，在評價(jià)某種化學(xué)物質(zhì)的毒性等級并探討其對水生生態(tài)系統(tǒng)的毒性影響時(shí)，必須綜合考慮包括浮游植物、浮游動(dòng)物等多種形態(tài)水生生物的毒理學(xué)研究結(jié)果，才能得出較為準(zhǔn)確的評價(jià).另酚類化合物具有顯著的生物積累性，可沿食物鏈傳遞并最終危害人體健康.因此，即使水中酚類化合物含量不高，也會對人類健康存在潛在危險(xiǎn)，應(yīng)引起各級部門的高度重視.

3 結(jié)論

不同濃度的5種酚類化合物處理后，3種水生生物的生長存在不同程度的減慢，表現(xiàn)為濃度越高，生長抑制效應(yīng)越強(qiáng).其中對苯二酚的毒性最強(qiáng)，2，4-二硝基酚的毒性最弱.

5種酚類化合對3種水生生物的毒性試驗(yàn)結(jié)果均具有較好的劑量-效應(yīng)線性關(guān)系.對苯二酚、間苯二酚、2，4-二氯苯酚、2，4-二硝基酚和 2，4，6-三硝基酚對水中浮游生物的安全閾值分別為 0.192、1.075、1.553、1.568和0.987 mg·L－1.因此嚴(yán)格控制酚類化合物的排放標(biāo)準(zhǔn)對生產(chǎn)、生態(tài)環(huán)境和人類健康尤為重要.

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THE TOXIC EFFECTS OF FIVE PHENOL COMPOUNDS TO THREE DIFFERENT AQUATIC ORGANISMS

XU Wenwu1MENG Jing2HU Wei1ZHANG Dian1ZHANG Tingting1

(1.College of Life Sciences，Anhui Normal University，The Key Laboratory of Biotic Environment and Ecological Safety in Anhui Province，Wuhu，241000，China;2.College of Environmental Science，Anhui Normal University，Wuhu，241000，China)

Based on the measurement of algae cell density and daphnia quantity，the inhibitory activities of five phenol compounds against three different aquatic organisms，i.e.Chlorella pyrenoidosa Chick，Scenedesmus obliquus and Moina macrocopa were tested.The results showed that the algal cell density was reduced significantly on the sixth day and the quantity of Moina macrocopa decreased sharply in 24 h with increasing phenol concentration，exhibiting a good concentration-effect relationship.On the sixth day，ErC50of hydroquinone， resorcinol， 2，4-dichlorophenol， 2，4-dinitrophenoland 2，4，6-nitro-phenolon Chlorella pyrenoidosa were 7.73，25.21，33.19，38.51 and 25.08 mg·L－1respectively，and those on Scenedesmus obliquus were 9.13，30.28，40.77，48.09 and 16.09 mg·L－1respectively.The 48 h LC50of hydroquinone，resorcinol，2，4-dichlorophenol，2，4-dinitrophenol，and 2，4，6-nitro-phenol on Moina macrocopa were 1.92，10.75，15.53，15.68 and 9.87 mg·L－1respectively.The results showed that hydroquinone had the strongest toxicity while 2，4-dinitrophenol had the weakest toxicity in the five phenol compounds.

aquatic organisms，phenol compounds，acute toxicity.

2010年11月19日收稿.

*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30870429);安徽省高校省級自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2008A084)資助.

＊＊通訊聯(lián)系人，E-mail:cyhztt@mail.ahnu.edu.cn