吳楠，李娜，劉歆韻，康廷國

（遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧 大連 116600）

菊花顯微特征常數與化學成分相關性研究

吳楠，李娜，劉歆韻，康廷國*

（遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧 大連 116600）

目的：探討菊花的顯微特征常數與其化學成分的相關性。方法：采用容量分析方法測定菊花粉末中的花粉粒的顯微特征常數值，采用高效液相法對菊花中指標性成分綠原酸進行含量測定，用統計方法對得到的兩組數據進行相關性分析。結果：菊花中花粉粒的顯微特征常數與綠原酸含量呈中相關，且為正相關。結論：測定菊花的顯微特征常數值，可作為其藥材質量控制的手段之一。

菊花；顯微特征常數；綠原酸；相關分析

中成藥顯微定量法是利用藥材自身的某種顯微特征具有固定常數的特點，采用容量分析法測定中成藥中藥材含量的一種方法。藥材的顯微特征常數與其化學成分是否具有相關性尚未見報道。本實驗對菊花中花粉粒顯微特征常數與其化學成分進行了線性相關研究，以探討藥材中所含無機物與有機物是否具有相關性，旨在為評價菊花的質量提供一種新的方法。

菊花為菊科植物菊Chrysanthemum morifoliumRamat.的干燥頭狀花序，其味甘、苦，微寒。入肺、肝經。散風清熱，平肝明目，清熱解毒。用于風熱感冒，頭痛眩暈，目赤腫痛，眼目昏花，瘡癰腫毒。綠原酸、木犀草苷為菊花中有效成分［1］。

菊花粉末中的花粉粒顯微特征明顯，不僅具有生物學穩(wěn)定的特性，而且數量眾多，易于觀察計數［2-4］。本實驗采用容量分析方法測定了菊花中花粉粒的顯微特征常數，采用高效液相法對菊花中的指標性成分綠原酸進行了含量測定，并對得到的結果進行了相關性分析［5］。

1 儀器、試劑與材料

1.1 儀器

OLYMPUSBX-50生物顯微鏡；OLYMPUSDP-10顯微鏡數碼相機；島津 AY220電子分析天平；Agilent1100高效液相色譜儀；微量移液器（WKY型－球晶生化試劑儀器有限公司）；FW80高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試劑

水合氯醛，稀甘油；綠原酸對照品（中國藥品生物制品檢定所）；其他試劑均為分析純或色譜純。

1.3 材料

所有菊花樣品均經遼寧中醫(yī)藥大學藥學院中藥鑒定教研室翟延君教授、李峰教授鑒定為正品，具體來源見表1。

表1 菊花樣品來源

2 方法與結果

2.1 菊花中花粉粒顯微特征常數測定優(yōu)化條件選擇

影響樣品混懸效果的因素主要有樣品重量、樣品的粉碎粒度、混懸劑的用量?？紤]到各因素的考察水平有所不同，故本實驗采用3因素6水平均勻設計法考察菊花顯微定量法的優(yōu)化條件［6］，具體實驗設計見表2。

取菊花樣品粉碎，分別過80目和100目篩。精密稱定50，60，70，80，90，100 mg共6份，用水合氯醛試液多次水飛，移入25mL量瓶中，按均勻設計表加入相應甘油量，最后用水合氯醛液定容。充分搖勻后，精密吸取0.02mL進行顯微裝片，每份溶液平行裝片50張，于顯微鏡下觀察花粉粒并計數。將所得的結果隨機分為5組，分別計算5組平均值的RSD。以每份樣品平均值的RSD為考察指標，實驗結果見表3。

表2 菊花中花粉粒顯微特征常數測定均勻設計方案U6（63）

表3 菊花中花粉粒顯微特征常數測定均勻設計實驗結果

通過SPSS 15.0統計軟件得出均勻設計結果，Y＝9.385－0.062X1，r＝0.906，F＝62.856，Ymin＝3.185（即3.185%）。式中Y為 RSD（%），X1為樣品重量，X2為粉碎粒度，X3為加入甘油量。經SPSS 15.0統計軟件得出其他變量P值均大于0.05，與Y值無顯著的相關性。即優(yōu)化條件為：樣品稱樣量100 mg，粉碎過100目篩，加入甘油7mL。

2.2 均勻設計驗證實驗

對優(yōu)化結果進行驗證實驗，結果表明各份樣品的變異系數均與優(yōu)化條件給出的最小變異系數（3.185%）接近，說明由SPSS 15.0統計軟件給出的優(yōu)化條件是科學、準確的，結果見表4。

表4 菊花中花粉粒顯微特征常數測定均勻設計驗證實驗結果

2.3 菊花各樣品顯微特征常數值測定

分別精密稱定10種菊花粉末，按照均勻優(yōu)化條件配制，水合氯醛多次水飛，分別定容于25mL量瓶中，精密吸取10μL溶液，分別平行裝片50張，觀察花粉粒，計數，取平均值，計算花粉粒顯微特征常數值，公式：P＝（X×V）／（V′×W），式中W－藥材重量（mg，按干燥品計），V－定量藥材混懸液總體積（mL），P－定量藥材顯微特征常數（個·mg－1），V′－蓋玻片下藥材混懸液體積（mL），X－每片蓋玻片下藥材顯微特征數，結果見表5。

表5 菊花中花粉粒顯微特征常數測定結果

2.4 高效液相色譜法測定綠原酸的含量

2.4.1 色譜條件與系統適應性試驗 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以0.1%磷酸溶液－乙腈（85∶15）為流動相；檢測波長為348nm。

2.4.2 對照品溶液的制備 精密稱取綠原酸對照品，加70%甲醇配制成每lmL含綠原酸35μg的溶液，即得。

2.4.3 供試品溶液的制備 取本品粉末（過1號篩）約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率300W，頻率45 kHz）40min，放冷再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.4 測定方法 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各5μL，注入液相色譜儀，測定方，即得［1］。

2.4.5 測定結果 見表6。

2.5 相關性分析

這兩組數據均經過正態(tài)分布檢驗且均符合進行相關性分析的條件，再用SPSS 15.0統計軟件對菊花樣品中花粉粒顯微特征常數與綠原酸的含量做相關性分析，結果表明，綠原酸的含量與菊花中花粉粒顯微特征常數有相關性，且呈正相關，即顯微特征常數愈大，綠原酸含量愈大。綠原酸與花粉粒的回歸方程：Y＝177.27X＋262.34，r＝0.697，P＝0.037（P＜0.05），有統計學意義。

表6 菊花中綠原酸含量測定結果

《中國藥典》2010年版規(guī)定，菊花按干燥品計算，含綠原酸（C16H18O9）計，不得少于0.20%。由所得回歸方程可知，含量達到《中國藥典》標準的菊花粉末中花粉粒的顯微特征常數應不少于262.7個·mg－1。

3 討論

本實驗采用容量分析法測定菊花顯微特征常數，定容和制片很關鍵，用微量移液器裝片前槍頭要潤洗3次，吸取前要使混懸液均勻分布，且盡量將槍頭伸入中間位置吸取，每次吸取前要充分搖勻，以減少誤差。蓋蓋玻片時要將載玻片上的溶液全部覆蓋，避免外溢現象。在顯微鏡下視野按 “之”字形觀察，不可重復計數［7-9］，不可遺漏。

基于花粉粒顯微鑒定專屬性強、穩(wěn)定性好、制片簡單、特征明顯易辨認的特點，建議《中國藥典》增加某些花類、含花全草類以及含花類原粉的中成藥的花粉粒顯微鑒定標準，使花粉粒在顯微鑒定中發(fā)揮更大作用。

建議《中國藥典》將顯微特征常數與化學成分具有顯著相關性的藥材項下增加顯微特征常數測定項，豐富藥材品質評價的內容；同時將含有這些藥材（原粉入藥）的中成藥項下增加顯微定量項。另外，杭菊在蒸制過程中花粉粒數量是否有變化尚需進一步研究。

［1］國家藥典委員會.中國藥典（一部）［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：292.

［2］康廷國.中藥鑒定學［M］.北京：中國中醫(yī)藥出版社，2003.

［3］徐國鈞.中藥材粉末顯微鑒定［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1986.

［4］欒曉靜，苑冬敏，康廷國.草酸鈣簇晶在中藥顯微鑒定中的應用［J］.遼寧中醫(yī)藥大學學報，2006，8（5）：137.

［5］苑冬敏，欒曉靜，康廷國.中藥顯微定量法的應用研究［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2006，（4）：444-445

［6］劉明芝，周仁郁.中醫(yī)藥統計學與軟件應用［M］.北京：中國中醫(yī)藥出版社，2006：8.

［7］欒曉靜，苑冬敏，康廷國.五子衍宗丸中枸杞子的顯微定量研究［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2007，34（5）：646.

［8］苑冬敏，劉揚，康廷國，等.黃柏的顯微定量研究［J］.中華中醫(yī)藥學刊，2007，25（5）：964.

［9］劉歆韻，劉麗，康廷國，等.白芍顯微特征常數與化學成分相關性研究［J］.中藥材，2010，33（4）：559.

Research of Correlation of Microscopic Characteristic Constants and Chemical Components of Chrysanthemi Flos

WU Nan，LINa，LIU Xin-yun，KANG Ting-guo
（Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600，China）

Objective：Discussion of the microscopic characteristics of chrysanthemi flos constant chemical composition and its relevance.Methods：Determination of the capacity analysis of chrysanthemi flos powder pollen number of the microscopic characteristics and the use of HPLC chrysanthemi flos of indicators of the chemical constituents chlorogenic acid，statistical methods used to obtain two sets of data for correlation analysis.Results：Chrysanthemi flos powder pollen and the microscopic characteristics chlorogenic acid significant content related to each other.ConclusionDetermination of the microscopic characteristics of chrysanthemi flos constant value，its ingredients can be used as a means of quality control.

Chrysanthemi flos；Microscopic characteristics of constant；Chlorogenic acid；Correlation analysis

*康廷國，E－mail：kangtg＠lnutcm.edu.cn

2010-10-20）