葛任新 李月娥

廣東省高州市中醫(yī)院，廣東高州 525200

不同產(chǎn)地鐵莧菜中總黃酮的含量測定

葛任新 李月娥

廣東省高州市中醫(yī)院，廣東高州 525200

目的測定不同產(chǎn)地鐵莧菜中總黃酮的含量。方法采用乙醇溶劑浸提，結(jié)合超聲波輔助提取鐵莧菜中總黃酮。對提取溫度、料液比、乙醇濃度進行L9（33）正交選擇試驗。結(jié)果最佳提取條件：提取溫度60℃，料液比1 g︰40 mL，乙醇濃度70%。4個不同產(chǎn)地藥材，以徐州產(chǎn)鐵莧菜中總黃酮含量最高，為5.4646 mg/g。結(jié)論鐵莧菜中總黃酮的含量因產(chǎn)地不同而存在一定的差異。

鐵莧菜；總黃酮；正交試驗；含量測定

鐵莧菜為一年生草本，高30～50 cm。葉互生，薄紙質(zhì)，橢圓形、橢圓狀披針形或卵狀菱形，基部有3出脈，長2.5～8 cm，寬1.5～3.5 cm，兩面被稀疏柔毛或無毛；葉柄長1～3 cm?；▎涡?，雌雄同序，無花瓣；穗狀花序腋生；雌花萼片3，子房3室，被疏毛，生于花序下端的葉狀苞片內(nèi)；苞片開展時腎形，長約1 cm，合時如蚌，邊緣有鋸齒；雄花多數(shù)生于花序上端，花萼4裂，裂片鑷合狀；雄蕊8，花藥長圓筒形，彎曲；無退化子房及花盤。蒴果小，鈍三棱狀，直徑約3～4 mm[1]。

鐵莧菜生于曠野、路邊較濕潤的地方。分布黃河流域中下游及長江以南各地，主產(chǎn)于江蘇、廣東、廣西、福建、四川、江西、安徽等地。鐵莧菜主要含有黃酮、生物堿、鞣質(zhì)、鐵莧菜素、沒食子酸、胡蘿卜苷、谷甾醇等有效成分。臨床主要用于熱毒瀉痢、血熱出血、外傷出血等癥。

含鐵莧菜的制劑：止瀉定膠囊系福建省立醫(yī)院兒科葉孝禮主任醫(yī)師30多年來治療濕熱泄瀉的經(jīng)驗方，它由中草藥鐵莧菜（Acalypha australis L.）與鹽酸黃連素、甘草等組成，由福州中藥廠研制成膠囊劑，并經(jīng)臨床研究，取得較滿意的療效[2]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鐵莧菜藥材（產(chǎn)地：江蘇徐州、河南柳州、湖北神農(nóng)架、河北邯鄲）；蘆丁、生化試劑購自廣東省藥品檢驗所；乙醇、醋酸鈉、冰醋酸、AlCl3均為分析純；蒸餾水。

1.2 主要設(shè)備

MODEL HN1006超聲波清洗機來自中國華南超聲設(shè)備廠；Unico柯尼龍WFZ UV-2100紫外可見分光光度計來自上海儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋；流水式中藥粉碎機來自溫嶺市大德中藥機械有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 工作曲線回歸方程的建立

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精確稱取120 ℃干燥至恒重的蘆丁對照品10 mg，至100 mL容量瓶中，加體積分數(shù)70%乙醇適量，超聲處理5 min使溶解，用70%乙醇定容至刻度，搖勻，即得（每1毫升含無水蘆丁0.1 mg）。

2.1.2 顯色劑的配制 稱取AlCl3 1.34 g ，乙醇定容至100 mL，配成0.1 mol/L的溶液。稱取醋酸鈉2.72 g，蒸餾水溶解至100 mL，配成0.2 mol/L的溶液。稱取1.15 mL冰醋酸，蒸餾水溶解至100 mL，配成0.2 mol/L的溶液。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 精密量取對照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0，平行兩份（差示法），分別置于10 mL容量瓶中，第1份直接加入2 mL 0.1 mol/L AlCl3溶液，乙醇定容，充分顯色20 min。第2份加入pH為5.2的NaAc-HAc緩沖溶液（0.8 mL 0.2 mol/L醋酸鈉溶液+2 mL 0.2 mol/L醋酸溶液），乙醇定容。以第2瓶為參比（差示法扣除背景干擾），用可見分光光度計在415 nm波長處測定其吸光度（ΔA）。以差示吸光度ΔA為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，計算回歸方程。

2.2 總黃酮的提取和測定方法

2.2.1 總黃酮的提取 精密稱取樣品1.5 g置于50 mL錐形瓶中，加一定體積分數(shù)乙醇若干毫升（按正交試驗做），于超聲波反應(yīng)器中（控制好溫度），提取 30 min（15 min，10 min，5 min），濾過，洗滌，濾液用蒸餾水定容于100 mL容量瓶中，得到黃酮提取液，待測。

2.2.2 總黃酮含量的測定方法 精密吸取提取液1.0 mL置于5 mL容量瓶中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項下的方法，依法顯色，測定吸光度ΔA，并由標(biāo)準(zhǔn)曲線或回歸方程計算樣品中總黃酮的含量。

2.3 正交試驗

正交選用江蘇徐州鐵莧菜藥材。然后以最佳提取條件按相同方法測定其他產(chǎn)地的鐵莧菜。利用正交試驗考察提取溫度、料液比、乙醇濃度這3個因素對提取效果的交互影響。試驗用L9（33）正交表，研究提取條件對提取效果的影響的大小，并確定最佳工藝。設(shè)3因素3水平正交試驗，3因素分別為溫度A、料液比B、乙醇濃度C。見表1。

表1 試驗因素水平

表2 正交試驗設(shè)計及結(jié)果分析

由極差分析可知，各因素對提取效果影響的大小順序是：A＞C＞B，即提取溫度＞乙醇濃度＞料液比 。從正交試驗設(shè)計及結(jié)果分析表可得出最優(yōu)化組合為A2B2C3，即提取溫度為60 ℃，料液比為1 g ： 40 mL，乙醇體積分數(shù)為70%。

2.4 結(jié)果

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程

2.5 方法學(xué)考察

以下實驗均按最佳提取條件提取總黃酮，藥材均為江蘇徐州鐵莧菜。

2.5.1 精密度試驗 精密量取3.0 mL項下的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液連續(xù)重復(fù)測定吸光度6次。計算得RSD=0.106%，結(jié)果表明該議器測量精密度優(yōu)良。

2.5.2 重現(xiàn)性試驗 稱取江蘇徐州產(chǎn)的鐵莧菜藥材粉末6份，按樣品溶液制備方法處理（分出兩份，一份作為差示法的參比溶液），依法顯色，在415 nm處測定吸光度。計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=1.842%，結(jié)果表明該方法重現(xiàn)性良好。

表3 不同產(chǎn)地鐵莧菜藥材總黃酮的含量

2.5.3 穩(wěn)定性實驗 精密量取江蘇徐州產(chǎn)地的鐵莧菜藥材樣品溶液1.0 mL，60 min內(nèi)每隔5 min測定一次吸光度。計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD。

2.5.4 加樣回收率試驗 精密移取樣品溶液1.0 mL（6份），分別加入0.1 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液 0.16 mL（加入與藥材總黃酮原有量相當(dāng)?shù)牧縨g），搖勻，依法（各平行2份，以第2份作為參比）顯色，依法測定吸光度，計算平均回收率為99.63%，以及RSD=0.54%。結(jié)果表明，方法分析誤差較小，操作計程中損失少，回收率高，方法可靠。

3 討論

超聲波提取法是近年來被用于中藥提取的一項新技術(shù)，它是利用超聲波產(chǎn)生的強烈振動、高的加速度、強烈的空化效應(yīng)、攪拌等作用，加速藥物有效成分進入溶劑[3-4]，較其他方法簡單快速，且反應(yīng)液測定時干擾因素少，結(jié)果可靠準(zhǔn)確[5]。因此本研究采用超聲波分別用3種方法提取鐵莧菜中的總黃酮，結(jié)果顯示最佳提取條件為：提取溫度60 ℃，料液比1 g ︰40 mL，乙醇濃度70%。進一步研究表明，3個影響因素基本無交互作用，因此選用正交表安排試驗，提高總黃酮的提取率，減少高溫對成分的破壞。

本實驗以紫外可見分光光度法測定鐵莧菜中總黃酮的含量，方法簡便易行，專屬性強，結(jié)果穩(wěn)定，重現(xiàn)性好。4個不同產(chǎn)地藥材，結(jié)果以徐州產(chǎn)鐵莧菜中總黃酮含量最高，為5.464 6 mg/g。結(jié)果表明鐵莧菜中總黃酮的含量因產(chǎn)地不同而存在一定的差異。

黃酮類化合物廣泛存在于自然界的植物中，具有多種生物學(xué)活性，是中藥材藥物內(nèi)的一類重要化學(xué)成分，具有多種藥理作用，諸如抗炎、抗氧化、抗癌和抗腫瘤作用等。上述實驗表明，鐵莧菜中含有極為豐富的黃酮類物質(zhì)，但不同產(chǎn)地的鐵莧菜中所含有的總黃酮成分存在較大的差異，這可能與藥材的生長環(huán)境、采收季節(jié)、提取方法以及貯藏條件等都有一定的關(guān)系。

[1]中國科學(xué)院植物研究所.中國高等植物圖鑒[M].北京：科學(xué)出版社，1972：605.

[2]鄭興中，倪峰.止瀉定膠囊的體內(nèi)抗菌與止瀉作用[J].中藥新藥與臨床藥理，1994，5（1）：27-29.

[3]王辰，高玲.超聲波輔助提取葛根黃酮的的工藝研究[J].長江大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2009，6（4）：61-64.

[4]丁芳林，彭書練.超聲提取荷葉黃酮工藝研究[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，（6）：175-177.

[5]梁新紅.分光光度法測定仙人掌中總黃酮的的含量[J].中國釀造，2007，（6）：67-69.

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2095-0616（2011）17-42-02

2011-06-27）