張旭強(qiáng)，何 旭，陳俊雅，胡文帥，彭 芳

（大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000）

美洲大蠊提取物CⅡ-3對(duì)大鼠急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用

張旭強(qiáng)，何 旭，陳俊雅，胡文帥，彭 芳*

（大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000）

目的：研究美洲大蠊提取物CⅡ-3對(duì)大鼠急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用。方法：采用56°紅星二鍋頭制備大鼠急性酒精性肝損傷模型。通過(guò)檢測(cè)大鼠血清中ALT、AST、TG水平和肝組織中GSH、SOD和MDA的水平，以及肝臟病理學(xué)檢查來(lái)觀察CⅡ-3的效果。結(jié)果：CⅡ-3能降低肝損傷大鼠血清中ALT、AST、TG的水平（P＜0.01），降低肝組織中MDA含量、提高SOD和GSH的活性（P＜0.01）；肝組織病理學(xué)觀察可見(jiàn)，CⅡ-3各劑量組與模型組相比，大鼠肝臟脂肪變性、炎癥壞死均有所減輕，高劑量組改善最為顯著。結(jié)論：CⅡ-3對(duì)大鼠急性酒精性肝損傷有明顯的保護(hù)作用。

美洲大蠊；酒精性肝損傷；保護(hù)作用

近年來(lái)，酒精濫用和酒精依賴引起的疾病，全球增加了3倍，已成為當(dāng)今世界日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題〔1-2〕。眾所周知，短時(shí)間內(nèi)大量攝入酒精，可造成急性肝損傷，長(zhǎng)期大量飲酒可引發(fā)酒精性肝?。ˋlcoholic liver disease，ALD），初期通常表現(xiàn)為脂肪肝，進(jìn)而可發(fā)展成酒精性肝炎、酒精性肝硬化。隨著全球酒精消費(fèi)量的快速上升，ALD的發(fā)病率也呈逐年上升的趨勢(shì)，酒精已成為我國(guó)繼病毒性肝炎后導(dǎo)致肝損害的第二大病因〔3〕。目前，對(duì)ALD的研究雖然取得了一些進(jìn)展，但對(duì)其治療仍無(wú)令人滿意的藥物。從天然動(dòng)、植物中尋找具有生物活性的保肝藥物，已成為國(guó)內(nèi)外科研工作者研究的熱點(diǎn)之一。

美洲大蠊（Periplaneta americana）屬昆蟲(chóng)綱，蜚蠊目，蜚蠊科，俗稱蟑螂，性味咸、寒；具有破瘀化積、消腫、解毒、通利血脈之功效。自20世紀(jì)70年代以來(lái)，國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)美洲大蠊的研究取得了很好的進(jìn)展，先后開(kāi)發(fā)了美洲大蠊系列昆蟲(chóng)藥品，如康復(fù)新、心脈隆和肝龍等。隨著研究的不斷深入，有研究發(fā)現(xiàn)美洲大蠊提取物有抗菌〔4〕、抗腫瘤〔5〕活性。在肝損傷方面，近年研究表明，美洲大蠊提取物能抑制雛鴨體內(nèi)鴨乙型肝炎病毒的復(fù)制，對(duì)乙型肝炎的治療作用明顯〔6-7〕，而且對(duì)四氯化碳（CCl4）和刀豆蛋白A所致肝損傷有較好的保護(hù)作用〔8-9〕。但是，有關(guān)美洲大蠊對(duì)酒精性肝損傷作用的研究，未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究美洲大蠊另一個(gè)有效部位CⅡ-3對(duì)酒精性肝損傷的保護(hù)作用，為開(kāi)發(fā)酒精性肝病的防治藥物，提供相關(guān)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SD大鼠60只，雌雄各半，體重200±20 g，由昆明醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)：SCXK（滇）2005-0008。

1.2 試劑與儀器 美洲大蠊提取物CⅡ-3由云南省大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院劉光明教授提供（批號(hào)：20101223）；硫普羅寧為河南省新誼藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品（批號(hào)：100403）；56°紅星二鍋頭白酒為北京紅星股份有限公司產(chǎn)品（批號(hào)：20101102）；冰乙酸為天津市大茂化學(xué)試劑廠產(chǎn)品（批號(hào)：20080603）；無(wú)水乙醇為天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司產(chǎn)品（批號(hào)：090214）；試劑盒：谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）測(cè)試盒（批號(hào)：20101013）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）測(cè)試盒（批號(hào)：20101013）、甘油三酯（TG）測(cè)試盒（批號(hào)：20101012）、超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)試盒（批號(hào)：20101222）、丙二醛（MDA）測(cè)試盒（批號(hào)：20101008）、谷胱甘肽（GSH）測(cè)試盒（批號(hào)：20110322）、考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒（批號(hào)：20101222），以上試劑盒均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。

1.0 型高速低溫離心機(jī)（德國(guó)Heraeus），XW-80A型漩渦混合器（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）；MERRLERAE240型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；JH-C-06-04型紫外分光光度計(jì)（上海青華科技儀器有限公司）；H.S21-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 造模與給藥 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為6組，每組10只，即正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、硫普羅寧陽(yáng)性對(duì)照組（100 mg/kg）、CⅡ-3低劑量組（25 mg/kg）、CⅡ-3中劑量組（50 mg/kg）、CⅡ-3高劑量組（100 mg/kg）。各組大鼠每日實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前禁食不禁水6 h，各組大鼠均采用灌胃給藥，正常對(duì)照組和模型組給等量生理鹽水，各給藥組給予相應(yīng)藥物，1 h后除正常對(duì)照組外，其余各組灌胃56°二鍋頭白酒20 mL/kg，共10 d。

1.3.2 樣本采集與指標(biāo)檢測(cè) 最后一天灌胃給酒后，禁食不禁水12 h，各組動(dòng)物稱重，眼球取血，靜置1 h后，3 500 r/min離心15 min，分離血清備用。取血完畢后處死大鼠，立刻剖腹，摘取肝臟和脾臟并稱重，計(jì)算肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)。然后取肝左葉浸泡于10%福爾馬林中固定24 h，剩余肝臟分別制備成10%及1%肝臟勻漿備用。

1.3.3 檢測(cè)指標(biāo) 血清用于檢測(cè)ALT、AST、TG水平；10%肝臟勻漿用于檢測(cè)MDA、GSH水平；1%肝臟勻漿用于檢測(cè)SOD水平；10%福爾馬林固定的肝組織經(jīng)脫水，石蠟包埋，切片后進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察肝組織病理改變。

2 結(jié)果

2.1 各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物一般狀態(tài)觀察 實(shí)驗(yàn)期間，正常組大鼠精神充沛，活潑好動(dòng)，毛發(fā)光澤，飲食及大便未見(jiàn)異常，體重明顯增加。模型組大鼠均有不同程度的精神萎靡，活動(dòng)飲食減少，毛發(fā)不整，大便稀溏等表現(xiàn)。各給藥預(yù)防組大鼠精神狀態(tài)和飲食、大便等情況均較模型組有不同程度的改善，以CⅡ-3高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組改善最為明顯。

2.2 CⅡ-3對(duì)酒精性肝損傷大鼠肝臟和脾臟指數(shù)的影響 模型組的大鼠肝臟指數(shù)明顯升高，與正常組比較有顯著性差異（P＜0.05）；與模型組比較，CⅡ-3三個(gè)劑量組均能降低大鼠肝臟指數(shù)及脾臟指數(shù)（P＜0.05），呈劑量相關(guān)性。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 CⅡ-3對(duì)酒精性肝損傷大鼠的肝臟及脾臟指數(shù)的影響（±s，n=10）

表1 CⅡ-3對(duì)酒精性肝損傷大鼠的肝臟及脾臟指數(shù)的影響（±s，n=10）

注：與正常對(duì)照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05

組別 給藥劑量（/mg/kg） 肝臟指數(shù)（/g/g）×100 脾臟指數(shù)（/g/g）×100正常對(duì)照組 — 3.20±0.18# 0.18±0.06#模型對(duì)照組 — 4.21±0.36* 0.34±0.12* CⅡ-3低劑量組 25 3.79±0.27*# 0.29±0.05*# CⅡ-3中劑量組 50 3.69±0.08*# 0.26±0.05*# CⅡ-3高劑量組 100 3.57±0.12*# 0.22±0.01*#硫普羅寧組 100 3.52±0.20*# 0.20±0.02*#

2.3 CⅡ-3對(duì)酒精性肝損傷大鼠血清中ALT、AST和TG水平的影響 模型組大鼠血清中ALT、AST和TG水平明顯升高，與正常組比較有顯著性差異（P＜0.01），提示造模成功；CⅡ-3三個(gè)劑量組均能顯著降低大鼠血清中ALT、AST和TG的水平，與模型組相比具有顯著性差異（P＜0.01），呈劑量相關(guān)性。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 CⅡ-3對(duì)酒精性肝損傷大鼠血清中AST、ALT和TG的影響（±s，n=10）

表2 CⅡ-3對(duì)酒精性肝損傷大鼠血清中AST、ALT和TG的影響（±s，n=10）

注：與正常對(duì)照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01

組別 給藥劑量（/mg/kg） ALT（/IU/L） AST（/IU/L） TG（/m mol/L）空白對(duì)照組 — 27.31±3.52## 41.58±7.40## 1.03±0.52##模型對(duì)照組 — 103.27±12.58** 120.40±18.15** 3.10±0.69** CⅡ-3低劑量組 25 79.28±9.49**## 91.88±10.76**## 2.34±0.45**# CⅡ-3中劑量組 50 62.71±10.89**## 77.90±8.86**## 1.66±0.44*## CⅡ-3高劑量組 100 32.12±4.10## 55.16±6.84*## 1.21±0.37*##硫普羅寧組 100 30.51±5.63## 47.99±4.65## 1.18±0.28##

2.4 CⅡ-3對(duì)酒精性肝損傷大鼠肝組織中SOD、GSH和MDA水平的影響 與模型組相比，CⅡ-3三個(gè)劑量組能明顯的降低組織中MDA的含量及升高組織中SOD和GSH的水平（P＜0.01），并呈劑量相關(guān)性。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 CⅡ-3對(duì)酒精性肝損傷大鼠肝組織中SOD、MDA和GSH的影響（±s，n=10）

表3 CⅡ-3對(duì)酒精性肝損傷大鼠肝組織中SOD、MDA和GSH的影響（±s，n=10）

注：與正常對(duì)照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01

組別 給藥劑量（/mg/kg） MDA（/nmol/mgprot） SOD（/U/mgprot） GSH（/mg/gprot）空白對(duì)照組 — 3.13±0.35## 216.15±19.34## 5.18±0.0.67##模型對(duì)照組 — 8.66±0.73** 125.06±8.32** 1.86±0.24** CⅡ-3低劑量 25 6.81±0.90**## 152.48±13.34**# 2.62±0.31**# CⅡ-3中劑量 50 5.73±0.62**## 173.69±7.47**## 3.79±0.67**## CⅡ-3高劑量 100 3.76±0.76*## 201.78±18.54*## 4.73±0.76##硫普羅寧組 100 3.46±0.51## 208.38±12.90## 5.04±0.41##

2.5 CⅡ-3對(duì)大鼠肝臟組織病理學(xué)的影響 光鏡下可見(jiàn)，正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞索排列整齊，呈放射狀排列，肝竇正常，胞核結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整；模型組大鼠肝小葉界限不清，肝細(xì)胞索紊亂，肝竇變窄，胞漿內(nèi)出現(xiàn)彌漫性大小不等的脂滴，可見(jiàn)點(diǎn)狀壞死和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，胞核模糊不清；各治療組損傷有不同程度的減輕，以高劑量組和陽(yáng)性組較為明顯，肝小葉結(jié)構(gòu)較清晰，肝細(xì)胞索排列整齊，肝竇基本恢復(fù)正常，胞漿中偶見(jiàn)少量的脂滴。見(jiàn)圖1。

圖1 CⅡ-3對(duì)大鼠急性酒精性肝臟損傷后肝臟組織形態(tài)學(xué)的影響（×400）

3 討論

肝臟是體內(nèi)代謝乙醇的主要場(chǎng)所，乙醇被機(jī)體吸收后，約90%在肝臟內(nèi)代謝。乙醇在肝臟經(jīng)乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶脫氫氧化為乙醛和乙酸，再通過(guò)體循環(huán)而被人體代謝。此過(guò)程中肝細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生較多的活性氧自由基（ROS），包括O2·－、H2O2、·OH、C2H5O·和C2H5OH，這些自由基具有極強(qiáng)氧化能力，會(huì)攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引起脂質(zhì)過(guò)氧化，并產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，進(jìn)而造成肝細(xì)胞膜通透性增加和肝細(xì)胞內(nèi)線粒體損傷，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)的損害〔10-11〕。

MDA是氧自由基與生物膜多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物，MDA含量可以間接的反映出機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的程度，MDA的增加表明組織細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化物量的增加，故檢測(cè)MDA同時(shí)可反映氧自由基的水平及脂質(zhì)過(guò)氧化的程度〔12〕。SOD是機(jī)體內(nèi)清除自由基的重要抗氧化酶之一，SOD及MDA含量的高低可反映氧自由基水平和脂質(zhì)過(guò)氧化的強(qiáng)度與速率。GSH是一種低分子清除劑，對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化自由基具有較強(qiáng)的清除作用，GSH在抵抗酒精所致的肝損傷中起關(guān)鍵作用，酒精在體外和體內(nèi)均可使肝臟GSH含量顯著降低，GSH含量的減少可能是酒精導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化增強(qiáng)的原因之一〔13-14〕。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：模型組大鼠肝組織MDA水平明顯高于正常組，SOD和GSH的水平明顯低于正常組，而且CⅡ-3各劑量組能夠降低肝組織中MDA水平及升高SOD水平，推測(cè)其可能通過(guò)抗脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)而產(chǎn)生較好的肝臟保護(hù)作用。

ALT是反映肝細(xì)胞損害最直接和最敏感的指標(biāo)，主要位于肝細(xì)胞胞漿內(nèi)，當(dāng)飲酒過(guò)多造成急性酒精性肝損傷時(shí)，肝細(xì)胞受損、肝細(xì)胞膜通透性增加，胞漿內(nèi)ALT升高，同時(shí)借助于濃度梯度透過(guò)細(xì)胞膜，進(jìn)入血循環(huán)，引起肝組織和外周血清中ALT濃度的升高。而AST主要位于肝細(xì)胞線粒體內(nèi)，飲酒過(guò)多后可造成肝細(xì)胞嚴(yán)重受損、線粒體水腫變性，肝組織和血清AST濃度也可明顯升高〔15〕。本實(shí)驗(yàn)顯示，模型組血清ALT、AST平均水平顯著高于空白組（P＜0.01），說(shuō)明急性酒精性肝損傷模型造模成功。CⅡ-3可顯著降低血清ALT、AST水平，表明CⅡ-3能夠減輕酒精對(duì)肝細(xì)胞造成的損傷，對(duì)肝細(xì)胞有一定的保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：CⅡ-3能促進(jìn)急性酒精性肝損傷大鼠的功能恢復(fù)，降低血清AL、AST的活性和TG的含量；提高肝內(nèi)抗氧化酶SOD及GSH的活性，降低脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的含量，提示美洲大蠊提取物CⅡ-3可能是通過(guò)抗脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，抑制肝內(nèi)氧自由基的生成，從而對(duì)酒精所致大鼠急性肝損傷發(fā)揮一定保護(hù)作用。

〔1〕Moriarty K J，Platt H，Crompton S，et al.Collaborative care for alcohol-related liver disease〔J〕.Clin Med，2007，7（2）：125-128.

〔2〕Bruhar，Dvoak K，Dousa M，et al.Alcoholic liver disease〔J〕.Prague Med Rep，2009，110（3）：181-190.

〔3〕趙可，李弼民.酒精性肝病的研究進(jìn)展〔J〕.實(shí)用臨床醫(yī)學(xué)，2006，7（12）：194-197.

〔4〕藍(lán)江林，周先治，卓侃，等.美洲大蠊（Periplaneta americana）抗菌肽殺菌作用初步觀察〔J〕.福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2004，33（2）：166.

〔5〕何正春，彭芳，宋麗艷，等.美洲大蠊化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展〔J〕.中國(guó)中藥雜志，2007，32（21）：2326-2331.

〔6〕杜一民，陳鴻珊，李樹(shù)楠，等.治療乙型肝炎新藥肝龍膠囊的藥效學(xué)初步研究〔J〕.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2006，17（8）：1369-1371.

〔7〕高永翔，扈曉宇，鐘森，等.蟑螂提取物抗肝損傷及抗病毒作用探討〔J〕.國(guó)際中醫(yī)中藥雜志，2006，28（3）：155-158.

〔8〕李武，段麗芳，何貴清，等.美洲大蠊提取物對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化的影響〔J〕.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21（5）：1137-1138.

〔9〕甘平，張旭強(qiáng)，何旭，等.美洲大蠊醇提物對(duì)小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用〔J〕.現(xiàn)代藥物與臨床，2011，17（8）：123-128.

〔10〕Lalor P F，F(xiàn)aint J，Aarbodem Y，et al.The role of cytokines and chemokines in the development of steatohepatitis〔J〕. Senin Liver Dis，2007，27（2）：173-193.

〔11〕Rouach H，F(xiàn)ataccioli V，Gentil M，et al.Effect of chronicethano feeding on lipid peroxidation and protein oxidation in relation to live pathology〔J〕.Hepatology，1997，65（5）：351-355.

〔12〕Teare J P，Greenfield S M，Watson D，et al.Lipid peroxidation in rats chronically fed ethano〔lJ〕.Gut，1994，35（1）：1644-1647.

〔13〕曲海波，宗建成，王海蘋，等.烏丹醒肝顆粒對(duì)大鼠急性酒精性肝損傷的影響〔J〕.齊魯藥事，2006，25（12）：757.

〔14〕王憲齡，盧依平.柴胡黃芩配伍抗大鼠急性酒精性肝損傷作用研究〔J〕.中藥藥理與臨床，2005，21（4）：10.

〔15〕Suchy J，Sokol R J，Balislreri W F.Liver disease in children〔M〕.2th ed.Philadelphia：JB Lippincott 2001：155-169.

Protective Effects of Periplaneta Americana Extract CⅡ-3 against Acute Hepatic Injury Induced by Alcohol in Rats

ZHANG Xuqiang,HE Xu,CHEN Junya,HU Wenshuai,PENG Fang*
（School of Pharmacy and Chemistry,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To investigate the protective effects of CⅡ-3,which was extracted from Periplaneta americana against acute hepatic injury induced by alcohol in rats.Methods:The rat model of acute hepatic injury was induced by stomach perfusion with 56° Red Star Liquor for 10 days and different doses of CⅡ-3 treatment.At the 11th day of the treatment,the ALT,AST,TG in rat serum and GSH,SOD,MDA in liver homogenate were measured.At the end of the treatment,the rats were euthanized and the hepatic tissues were conduct to the histopathological examination.Results:Compared with the control group,CⅡ-3 treatment could remarkably reduce the levels of ALT,AST,TG and MDA(P＜0.01),and increase the levels of SOD and GSH(P＜0.01);furthermore,CⅡ-3 treatment could mitigate hepatocyte fatty degeneration,cellular necrosis and inflammatory infiltration.Conclusion:CⅡ-3 extracted from Periplaneta americana may prevent rats from acute hepatic injury induced by alcohol.

Periplaneta americana;alcohol-induced hepatic injury;protective action

R285.5［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A［文章編號(hào)］1672-2345（2011）12-0001-05

2011-06-15

2011-09-01

張旭強(qiáng)，2009級(jí)藥物化學(xué)碩士研究生.

*通信作者：彭芳，教授，碩士研究生導(dǎo)師.

（責(zé)任編輯 毛本勇）