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        拮抗細菌B-05的鑒定及發(fā)酵條件初探△

        2011-11-03 03:27:06蒲盛才韋中強
        中國現(xiàn)代中藥 2011年7期
        關鍵詞:酵母粉染色法白芷

        蒲盛才,韋中強

        (重慶市藥物種植研究所,重慶 南川 408435)

        重慶市科技攻關計劃項目(CSTC,2009AC5134)

        *蒲盛才,E-mail:pushengcai1@163.com

        拮抗細菌B-05的鑒定及發(fā)酵條件初探△

        蒲盛才*,韋中強

        (重慶市藥物種植研究所,重慶 南川408435)

        目的為了初步鑒定從土壤中分離的一株拮抗性能強且抗性穩(wěn)定的菌株,并探索其抗菌物質的最佳發(fā)酵條件。方法對拮抗菌一般特征采用苯酚品紅染色法,芽孢采用孔雀石綠染色法,鞭毛采用西薩-基爾(Ceseres-Gill)染色法,生理生化測試采用常規(guī)的細菌生理生化測試方法進行鑒定。發(fā)酵條件分別開展培養(yǎng)基、發(fā)酵pH值、溫度、時間的篩選。結果經初步鑒定拮抗細菌B-05屬枯草芽孢桿菌??咕镔|最佳發(fā)酵條件為:在pH7.0的PDA培養(yǎng)基中,25℃恒溫培養(yǎng)96h后發(fā)酵液的抑菌效果最佳。結論發(fā)酵條件及抗菌性研究為抑菌物質的工廠化生產和應用提供了有價值的參考依據(jù)。

        白芷根腐病菌;拮抗細菌;鑒定;發(fā)酵條件

        白芷Angelicadahurica(Fisch.ex Hoffm.) Benth.et Hook.f為多年生草本植物,以根入藥,具解表散寒,祛風止痛,宣通鼻竅,燥濕止帶,消腫排膿的功能。白芷在中國西南地區(qū)主產于四川遂寧和重慶南川。白芷根腐病極其嚴重,常發(fā)生于白芷成熟期,時值7月下旬至8月中旬高溫高濕期間,發(fā)病率急劇上升,引起白芷塊根平均腐爛率達16%左右,重者可達30%以上。白芷根腐病由子囊菌中的菜豆殼球孢MacrophominaphaseolinaGoid引起[1],微菌核是其主要存在形式。白芷植株自身帶菌而致病,通常在白芷苗期和生長期發(fā)病癥狀不明顯,采挖期發(fā)病率急劇上升,加速腐爛,有時可造成全部爛掉,產量損失嚴重。生產中常采用硫磺熏蒸的方法防治該病,但近年發(fā)現(xiàn),硫磺熏蒸嚴重影響白芷質量,可使其主要有效成分——香豆素類物質降低70%左右[2-3]。鑒于硫磺熏蒸在白芷根腐病防治中的弊端,生物防治逐漸引起國內外研究學者的重視。迄今,未見有關白芷根腐病生物防治的研究報道。自1997年起,課題組以白芷根腐病菌為靶標菌,著手從土壤﹑植株體表﹑果實﹑植物莖桿中篩選生防菌株,最終從土壤中篩選出一株活性強、抗譜廣的細菌菌株B-05??咕盍υ囼灲Y果表明,除黑色曲霉菌外,B-05對供試25種真菌中的24種都表現(xiàn)極強的抗菌作用。5%~10%的B-05發(fā)酵液即可完全抑制白色曲霉菌、白芷根腐病菌、新型隱球菌、紅色酵母菌、黑色酵母菌和熱帶假絲等真菌的生長。同時發(fā)現(xiàn),B-05發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌、腸球菌和枯草桿菌等革蘭氏陽性細菌也表現(xiàn)出極強的抗菌作用,5%的B-05發(fā)酵液即可完全抑制金黃色葡萄球菌的生長(待發(fā)表)。上述研究結果表明,B-05具有重要的研究價值,有望開發(fā)新的抗菌藥物?,F(xiàn)將拮抗細菌B-05的初步鑒定及發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選結果報告如下。

        1 材料與方法

        1.1菌種

        拮抗細菌B-05,由重慶市藥物種植研究所分離保存。指示菌:白芷根腐病菌,由重慶西南農業(yè)大學裴炎教授惠贈。

        1.2培養(yǎng)基

        PDA液態(tài)培養(yǎng)基用于拮抗細菌B-05的培養(yǎng),PDA固體培養(yǎng)基用于白芷根腐病菌的培養(yǎng)。

        1.3菌種的鑒定

        1.3.1培養(yǎng)性狀 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA)上28℃培養(yǎng)2d后觀察培養(yǎng)性狀。

        1.3.2形態(tài)學觀察 觀察細菌的形態(tài)﹑包括細菌體形態(tài)﹑芽孢形態(tài)以及鞭毛等重要鑒別特征。一般特征采用苯酚品紅染色法,芽孢采用孔雀石綠染色法,鞭毛采用西薩-基爾(Ceseres—Gill)染色法,其余特征觀察參考文獻方法[4]。

        1.3.3生理生化測試 采用常規(guī)的細菌生理生化測試方法[5]。

        1.4培養(yǎng)基的篩選試驗

        本試驗共涉及12種培養(yǎng)基,分別為PDA液態(tài)培養(yǎng)基(馬鈴薯200g,葡萄糖20g,蒸餾水1000mL)、Richard溶液(硝酸鉀10g,磷酸二氫鉀5g,七水硫酸鎂2.5g,三氯化鐵0.02g,蔗糖50g,蒸餾水1000mL)、肉汁胨培養(yǎng)基(牛肉浸膏3.0g,蛋白胨5.0g,葡萄糖10.0g,蒸餾水1000mL。玉米粉培養(yǎng)基(玉米粉30g,蒸餾水1000mL)、PGY培養(yǎng)基(蛋白胨10g,酵母粉5g,葡萄糖1g,蒸餾水1000mL)、BPY培養(yǎng)基(蛋白胨10g,牛肉膏5g,酵母粉5g,NaCl5g,葡萄糖5g,蒸餾水1000mL)、LB培養(yǎng)基(酵母粉5g,蛋白胨10g,NaCl10g,蒸餾水1000mL)、葡萄糖酵母粉培養(yǎng)液(葡萄糖10g,酵母粉10g,蒸餾水1000mL)、Sabouraud氏培養(yǎng)基(葡萄糖40g,蛋白胨10g,蒸餾水1000mL)、淀粉培養(yǎng)基(可溶性淀粉10g,NaNO31g,NaCl0.5g,KH2PO40.3g,蒸餾水1000mL)、馬鈴薯汁培養(yǎng)基(去皮馬鈴薯200g,蒸餾水1000mL)、牛肉膏淀粉培養(yǎng)基(牛肉膏20g,蛋白胨10g,淀粉20g,pH7.2)。按以上比例配制液體培養(yǎng)基,搖勻后分裝50mL/瓶,0.1MPa·cm-2、121℃高壓滅菌20min,冷卻接種,接種量為50μL,接種濃度于25~30℃條件下培養(yǎng)96h,分別用移液管取2.6mL發(fā)酵液于50mL/瓶的PDA固體培養(yǎng)基中(相對濃度為5%),121℃高壓滅菌20min,凈化工作臺上倒平皿(Ф90mm),每瓶倒3皿,冷卻后將白芷根腐病菌餅(Ф7mm)接種到平皿培養(yǎng)基中央(注意菌種面必須接觸培養(yǎng)基)。PDA固體培養(yǎng)基加清水設空白對照,在恒溫培養(yǎng)箱中25~30℃培養(yǎng)48h后觀察。

        1.5發(fā)酵pH值、溫度、時間的研究

        該實驗研究了拮抗細菌B-05的各種發(fā)酵液的初始pH值、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間對試驗菌株抑菌作用的影響。綜合全部篩選結果即得最優(yōu)發(fā)酵條件。

        2 結果與分析

        2.1拮抗菌株的培養(yǎng)特征、形態(tài)觀察及生理生化測試結果

        菌株B-05在NA平板培養(yǎng)觀察,單個菌落乳白色,表面光滑有黏液,濕潤透明,圓形,有中央隆起,鏡檢為桿狀革蘭氏染色陽性,周身鞭毛,產生芽孢,芽孢橢圓形,在菌體中央或一端形成,兼性厭氧。生理生化測試:葡萄糖﹑甘露利用,淀粉水解、硝酸鹽還原、明膠液化、產氣實驗、V-P實驗、吲哚實驗和過氧化氫酶實驗均呈陽性。綜合菌種上述特征結合參考文獻[6],初步判斷拮抗細菌B-05為枯草芽孢桿菌。

        2.2拮抗細菌B-05發(fā)酵液抗白芷根腐病菌測試結果

        各種培養(yǎng)基B-05發(fā)酵液抗白芷根腐病菌實驗,培養(yǎng)48 h后觀察、測量、計算抑菌率,其實驗結果見表1。

        抑菌率計算公式:抑菌率=(對照菌落生長半徑-處理菌落生長半徑)/對照菌落生長半徑×100 %。

        表1 不同培養(yǎng)基的B-05發(fā)酵液對白芷根腐病菌的抑菌率

        注:(1) 測量直徑時,包含菌絲翻長接觸含藥培養(yǎng)基的一段菌絲,其抑菌率實質比計算得出的還要高,下同;(2)*為0.05水平顯著,** 為0.01水平顯著

        由表1可見,培養(yǎng)基對B-05的抑菌效果有重要影響,其中PDA培養(yǎng)基發(fā)酵液的抑菌效果最好。所以在后續(xù)試驗中發(fā)酵培養(yǎng)基均為PDA培養(yǎng)基。

        2.3初始pH值的考察

        將B-05分別接種到初始pH值4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的PDA培養(yǎng)基中測定抑菌活性,考察最適pH值。

        表2 初始pH值對抑菌作用的影響

        注:*為0.05水平顯著,** 為0.01水平顯著

        由表2可見PDA培養(yǎng)基初始pH值在中性微偏酸的條件下抑菌效果最好,強酸強堿都會導致抑菌效果的下降。

        2.4發(fā)酵溫度的考察

        將試驗菌株B-05分別在20,25,30,35℃發(fā)酵48h后測定發(fā)酵液的抑菌活性,考察最適發(fā)酵溫度。

        表3 發(fā)酵溫度對抑菌作用的影響

        注:*為0.05水平顯著,** 為0.01水平顯著。

        由表3可知,25 ℃左右時試驗菌株B-05抑菌效果最佳,溫度過高或過低均影響B(tài)-05菌株的抑菌效果。溫度太低,菌體生長緩慢,發(fā)酵時間長;溫度過高菌體雖然生長較快,但會影響抑菌物質的產生,所以后續(xù)試驗中發(fā)酵溫度均為25 ℃。

        2.5發(fā)酵時間的考察

        分別測定發(fā)酵48,72,96,120h后B-05菌株發(fā)酵液的抑菌活性,考察最適發(fā)酵時間。除發(fā)酵時間外其余發(fā)酵條件均相同。

        表4 發(fā)酵時間對抑菌作用的影響

        注:*為0.05水平顯著,** 為0.01水平顯著

        由表4可知,B-05抑菌效果隨發(fā)酵時間的變化而變化,發(fā)酵96 h時發(fā)酵液的抑菌效果最佳,發(fā)酵時間過長,抑菌率反而下降,可能是由于代謝產物的積累,造成了抑菌物質的減少,所以在后續(xù)試驗中發(fā)酵時間均為96 h。

        3 結論

        [1] 張玉方,余紅梅,歐陽鐵.白芷根腐病病原菌生物學特性研究[J].西南農業(yè)大學學報,1995,17(6):514.

        [2] 李宏宇,戴躍進,謝成科.中藥白芷硫熏前后香豆素類成分含量的比較[J].中國中藥雜志,1991,16(1):27.

        [3] 張玉方,余紅梅.硫熏對白芷香豆素類成分含量的影響研究[J].中國中藥雜志,1997,22(9):536.

        [4] 方中達.植病研究方法[M].北京:農業(yè)出版社,1979:194-196.

        [5] 東秀珠,蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京:科學出版社,2001:184.

        [6] 布坎南.R.E,吉本斯.N.E.伯杰氏細菌鑒定手冊[M].第八版.北京:科學出版社,1984:729-734.

        StudyonthePreliminaryIdentificationandFermentationConditionofAntagonisticB-05Strain

        PU Sheng-cai,WEI Zhong-qiang

        (ChongqingInstituteofMedicinalPlantCaltivation,Nantong408435,China)

        Objective: The aim of this study was to identify initially a strain with strong antagonistic action and stable resistance, which was separated from the soil and to explore the best optimum fermentation conditions of its antibacterial substance.MethodsFor the general characteristics of antagonistic bacteria, carbol fuchsia dyeing method was used. As for a gemma, schaeffer-fulton dyeing method was adopted. Ceseres-Gill dyeing method was introduced to the flagellum and the normal bacterial physiological and biochemical test methods was for physiological and biochemical test. The optimum fermentation conditions comprised developing medium and the sifting of pH value, temperature and time.ResultsAfter the initial identification, antagonistic bacteria B-05 was included by Bacillussubtilis. The best optimum fermentation conditions for the antimicrobial substances was kept constant temperature of 25 ℃ for 96 h in the pH 7.0 PDA medium.ConclusionThe optimum fermentation conditions and the antimicrobial study offered valuable references for the production and application of antibacterial substances.

        MacrophominaphaseolinaGoid; Antagonistic bacteria; Identification; Fermentation

        2011-01-07)

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