徐 淏，李士強，張東升，王紅連，匡 群，*

(1.江蘇省蘇微微生物研究有限公司，江蘇無錫214063; 2.江蘇安惠生物科技有限公司，江蘇南通226009)

以葛根為基質(zhì)的靈芝發(fā)酵顆粒沖劑的研制

徐 淏1，李士強2，張東升1，王紅連1，匡 群1，*

(1.江蘇省蘇微微生物研究有限公司，江蘇無錫214063; 2.江蘇安惠生物科技有限公司，江蘇南通226009)

研究以葛根為添加基質(zhì)的靈芝發(fā)酵顆粒沖劑的加工工藝。正交實驗結(jié)果表明:葛根添加量為6%時，靈芝最佳發(fā)酵條件為:轉(zhuǎn)速150r/min、裝液量160mL(500mL三角瓶)、接種量10%，發(fā)酵周期3d;以發(fā)酵菌體提取物、葛根異黃酮、麥芽糊精、蔗糖及檸檬酸等為原料，復配重量比為2∶12∶50∶40∶0.4，經(jīng)調(diào)配、造粒、干燥、滅菌等工藝，制成氣味、口感適宜的保健顆粒沖劑。

靈芝，葛根，發(fā)酵，顆粒沖劑

靈芝菌種 Ganoderma lucidum，食藥用菌研究室保藏;葛根渣 句容茅寶山葛業(yè)有限公司提供;葛根異黃酮提取物 研究室自提，總黃酮含量40%，葛根素含量＞16%;檸檬酸、麥芽糊精、蔗糖 市售，食品級;菌種活化培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基;種子培養(yǎng)基(g/L) 葡萄糖20，玉米粉20，豆餅粉5，MgSO4· 7H2O 0.75，KH2PO41.5，pH自然;發(fā)酵培養(yǎng)基 添加6%的葛根殘渣，其他同種子培養(yǎng)基。

粉碎機，超聲破碎儀，烘箱，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，滅菌鍋，ZP-96型回轉(zhuǎn)式搖床，5型噴霧干燥器，濕熱滅菌箱，搖擺顆粒機，WZZ-1自動指示旋光儀，紫外可見分光光度計。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程 葛根渣→靈芝培養(yǎng)基料→滅菌、冷卻→液體發(fā)酵→發(fā)酵菌絲體組織破碎→熱水浸提→過濾、濃縮→噴霧干燥→調(diào)配、混合(蔗糖、檸檬酸、葛根異黃酮)→過篩、造?！鷾缇稍铩！鷻z驗→包裝→成品

1.2.2 操作要點

1.2.2.1 靈芝的液體發(fā)酵 將保存的靈芝菌種接種到斜面培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)7d，進行活化。活化后的菌種接種到含160mL培養(yǎng)液的500mL三角瓶中，150r/min旋轉(zhuǎn)搖床28℃培養(yǎng)7d，為種子。在發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加6%的葛根渣，選擇不同的發(fā)酵時間、轉(zhuǎn)速、裝液量及接種量、產(chǎn)多糖含量高的條件作為最佳發(fā)酵條件，28℃液體發(fā)酵備用。

表1 液體發(fā)酵條件正交實驗結(jié)果

1.2.2.2 組織破碎、提取 發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)離心，過濾，分離菌絲體與母液。發(fā)酵菌絲體按料液比1∶10(以菌絲濕重計)，功率600W，超聲波處理30min，離心、過濾，濾渣再用相同料液比80℃水浸提，合并濾液。

1.2.2.3 濃縮、噴霧 為保持靈芝發(fā)酵液中有效成分及營養(yǎng)，采用低溫，抽真空濃縮，40～50℃，-0.7kg/cm2，濃縮至60℃，熱測比重為1.1g/mL備用。濃縮液在進風溫度155℃，出風溫度75℃，塔內(nèi)負壓100Pa的條件下噴霧干燥，收粉備用。

1.2.2.4 葛根異黃酮的增溶性處理 葛根異黃酮中葛根素水溶性和脂溶性都較差［4］，添加一定比例的β-環(huán)糊精，使異黃酮分子進入環(huán)糊精的空腔之中，形成包合物［5］，從而大大增加黃酮物質(zhì)的水溶性。取一定質(zhì)量葛根異黃酮(純度為40%)，用較少體積95%乙醇熱溶，緩緩滴加到含一定質(zhì)量濃度的β-環(huán)糊精的水溶液中，50Hz超聲1h后，在60℃下磁力攪拌混合6h，過濾、真空濃縮、冰箱預凍24h，冷凍干燥，粉碎即得異黃酮包合物。

1.2.2.5 配料 預先將蔗糖粉碎，過80目篩，與檸檬酸、異黃酮包合物、靈芝發(fā)酵提取物，按照配料比例投入混合機中進行混勻。

1.2.2.6 造粒 以85%的食用酒精做潤濕劑，用量為粉末重量的20%，邊攪拌邊緩慢加入混合機中，加蓋攪拌5min后出料。把料慢慢加入搖擺的顆粒機中，過15目不繡鋼篩網(wǎng)造粒。把濕顆粒平攤于烘盤中，放置于濕熱滅菌器中，105℃濕熱滅菌30min，抽真空于50℃下干燥80min。出料過15目的不繡鋼篩網(wǎng)搖擺顆粒機整粒備用。

1.2.2.7 測定指標與方法 胞內(nèi)、胞外靈芝多糖的測定:多糖=總糖-還原性糖，總糖含量:采用苯酚-硫酸法測定［6］;還原糖含量:采用堿性酒石酸銅溶液直接滴定法［7］測定;總黃酮的含量:采用硝酸鋁比色法［8］測定;三萜類化合物的含量:采用香草醛-硫酸比色法［9］測定;顆粒中靈芝多糖的測定:醇沉加堿性銅試劑沉葡聚糖，硫酸苯酚法［10］。

2 結(jié)果與分析

2.1 液體發(fā)酵條件的優(yōu)選

以液體發(fā)酵的時間、轉(zhuǎn)速、裝液量、接種量為影響因素，選用L9(34)正交實驗表，通過測定胞外多糖與胞內(nèi)多糖含量來優(yōu)選添加葛根后靈芝液體發(fā)酵的最佳條件。

在課程設(shè)計上要遵循專業(yè)用途日語的理論框架，以滿足學生的特定需求。整體來看要體現(xiàn)三大原則：第一，相關(guān)性原則。即實訓課程要與專業(yè)課程相關(guān)，把課程教學與實訓技能相結(jié)合；第二，延續(xù)性原則。要體現(xiàn)日語專業(yè)能力學習的延續(xù)性，在教材編撰上要規(guī)劃好學生未來一段時期內(nèi)能力的培養(yǎng)目標；第三，規(guī)范化原則。商務(wù)日語技能學習并不是盲目的，而是有針對性、有計劃性、規(guī)范性的撰寫。

由表2數(shù)據(jù)，查F分布臨界值表得F0.05(2，2)=19，F(xiàn)0.01(2，2)=99，“*”為有顯著性意義。分析表明，因素B、C、D對實驗結(jié)果有非常顯著的影響，A的影響不顯著。依據(jù)選取有顯著意義因素的最好水平，確定最佳工藝條件的原則，不顯著的因素可根據(jù)實際條件(節(jié)約、省時等)確定1個水平。發(fā)酵的周期以不低于微生物正常生長時間72h，發(fā)酵時間越少，耗能越低，染菌的幾率越小，在其它三因素中，裝液量與另兩個因素相比比較突出，這是針對500mL的搖瓶而得到的最佳裝液量，在此基礎(chǔ)上可進行小型發(fā)酵罐的小試實驗。因此，綜合上述分析，得到最佳的工藝條件為A1B2C2D2即發(fā)酵時間3d、轉(zhuǎn)速150r/min、裝液量160mL(500mL三角瓶)、接種量10%，此為添加葛根后靈芝發(fā)酵的最佳條件。

表2 顯著性分析

2.2 β－環(huán)糊精異黃酮包合物的制備

采用相溶解度實驗［11］。取不同質(zhì)量分數(shù)(0%、0.25%、0.5%、1.0%、2.0%)β-CD的水溶液各20mL，均加入過量葛根異黃酮0.3g，50Hz超聲波作用1h，60℃振蕩器避光振蕩24h，靜置3d、0.45μm濾膜過濾，濾液定容至100mL容量瓶中。取濾液0.5mL， 80%乙醇回流提取后，其余按照測定總黃酮的含量方法進行測定。以葛根異黃酮的摩爾濃度為縱坐標、β-CD的摩爾濃度為橫坐標作圖，進行線性回歸。經(jīng)回歸擬合的曲線為:Y=0.3188X+0.0127，相關(guān)系數(shù)為0.9960。由此說明包合物的摩爾組成比為1∶1［12］。

表3 配方優(yōu)選正交實驗表

表4 綜合評分表

2.3 顆粒沖劑配方優(yōu)選

實驗以靈芝發(fā)酵提取濃縮液、葛根異黃酮、蔗糖、檸檬酸及麥芽糊精的添加重量比為因素，選用L16(45)正交實驗表進行配方優(yōu)選制備靈芝葛根顆粒沖劑，每個配方顆粒取5g，以100mL溫水進行沖調(diào)，以感官狀態(tài)、沖溶性、色澤、滋味、氣味等評價指標進行評價打分，最后得到綜合評分。實驗結(jié)果見表3、表4，其中7號實驗配方的綜合評為最高，酸甜適中，苦感爽口，沖調(diào)無沉淀，有靈芝葛根特殊的氣味。

2.4 質(zhì)量指標

2.4.2 理化指標 水分≤6.0%，靈芝粗多糖≥0.3%，總黃酮≥4.0%，鉛(以Pb計)≤0.5mg/kg，砷(以As計)≤0.3mg/kg，銅(以Cu計)≤2.5mg/kg。

2.4.3 微生物指標 細菌總數(shù)(cfu/g)≤1000;大腸菌群(MPN/100g)≤40;霉菌(cfu/g)≤25;酵母(cfu/g)≤25;致病菌不得檢出。

3 結(jié)論

3.1 通過正交實驗確定了葛根靈芝液體發(fā)酵的最優(yōu)條件為:發(fā)酵時間3d，轉(zhuǎn)速150r/min，裝液量160mL (500mL三角瓶)，接種量10%。

3.2 靈芝葛根顆粒沖劑，因添加有麥芽糊精，粗多糖的檢測存在干擾，多以靈芝三萜為質(zhì)量指標，而該指標含量極低，產(chǎn)品質(zhì)量難以控制，通過醇沉加堿性銅試劑選擇性沉淀葡聚糖，該法可以解決這一困擾，以靈芝粗多糖為質(zhì)量指標，從而成功地對產(chǎn)品的質(zhì)量進行監(jiān)控。

3.3 通過實驗確定了以葛根為基質(zhì)的靈芝發(fā)酵菌絲體提取加工制成顆粒沖劑的可行性。但由于發(fā)酵產(chǎn)物成分復雜，其安全性還需進一步的實驗;此外，菌體超聲破碎規(guī)?；a(chǎn)有限，應(yīng)用溫和酶解處理有待進一步的探討。

［1］蘇軍凱，董閩田，張勇.葛根治療酒精中毒藥理研究進展［J］.海峽藥學，2000，12(4):1-3.

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［3］張東升，夏榮光，張凌裳.以葛根為基質(zhì)的靈芝發(fā)酵和體外清除自由基活性研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2009，37(31): 15429-15430.

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Preparation of Ganoderma lucidum granule with the fermented substrate of Pueraria ohwi

XU Hao1，LI Shi-qiang2，ZHANG Dong-sheng1，WANG Hong-lian1，KUANG Qun1，*
(1.Jiangsu Su Wei Institute of Microbiology Co.，LTD，Wuxi 214063，China; 2.Jiangsu Alphay Biological Technology Co.，LTD，Nantong 226009，China)

It was reported that processing technology for a granule on fermentation of Ganoderma lucidum with Pueraria ohwi.The results showed that the best conditions of fermentation as follows:inoculum 6%，liquid volum 160mL(in each 500mL flask)，stirring speed 150r/min and fermentation period 3days;Good quality and tasteful granule could be obtained by adopting raw material ration of concentrated mycelium extract，isoflavones of Pueraria ohwi，maltodextrin，sugar and citric acid at 2∶12∶50∶40∶0.4，after deployment，granulation，drying，sterilization and other processes.

Ganoderma lucidum;Pueraria ohwi;fermentation;granule

TS201.1

B

1002-0306(2011)09-0333-03

靈芝是我國傳統(tǒng)中藥中的補品，是一種營養(yǎng)價值、保健價值極高的大型擔子菌，其多糖具有增強免疫、扶正固本等作用。葛根為豆科植物葛(Pueraria lobata ohwi)的根，為藥、食同源的天然植物，具有保護心腦血管、抗氧化、解酒護肝［1］等作用?，F(xiàn)代研究表明，葛根的藥用價值依賴于主要活性物質(zhì)——葛根異黃酮，包括:葛根素、大豆苷、大豆苷元及葛根苷類［2］。本研究室張東升等［3］曾以自身發(fā)酵性能好的靈芝作為出發(fā)菌株，以壓榨水洗淀粉后的葛根渣為添加物進行了液體發(fā)酵，研究發(fā)現(xiàn)，葛根對靈芝菌絲體的生長具有促進作用，且發(fā)酵液的體外清除自由基的活性較單一物質(zhì)高。為此本研究以該靈芝發(fā)酵提取物、葛根異黃酮為主要原料，配以麥芽糊精、蔗糖及檸檬酸等輔料，采用真空噴霧干燥工藝，正交優(yōu)選最佳發(fā)酵條件及配方制備靈芝葛根顆粒沖劑。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

2010-09-20 *通訊聯(lián)系人

徐淏(1987-)，男，理學士，實習研究員，研究方向:功能性食品的研究與開發(fā)。