徐潔昕，方紅霞，楚文靖，汪慶軍

(黃山學(xué)院生命與環(huán)境學(xué)院，安徽黃山245041)

黃山貢菊多糖的微波浸提工藝和抑菌效果研究

徐潔昕，方紅霞，楚文靖，汪慶軍

(黃山學(xué)院生命與環(huán)境學(xué)院，安徽黃山245041)

利用響應(yīng)面設(shè)計(jì)法和微波浸提法優(yōu)化黃山貢菊的多糖提取工藝，多糖含量測(cè)定采用苯酚-硫酸法，并對(duì)多糖提取液進(jìn)行了抑菌效果實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明:微波功率、浸提時(shí)間和pH因素對(duì)貢菊多糖提取率有顯著影響，得出微波輔助提取貢菊多糖的最優(yōu)工藝參數(shù):微波功率為530W，提取時(shí)間為22min，液料比38∶1，多糖浸提液pH為6.7，實(shí)際多糖得率為6.18%。抑菌實(shí)驗(yàn)表明:貢菊多糖的抑菌效果良好，貢菊多糖對(duì)大腸桿菌和蘇云金芽孢桿菌的最小抑菌濃度為10mg ·mL-1。

黃山貢菊，多糖，微波輔助提取工藝，抑菌效果

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃山貢菊 市售;無(wú)水葡萄糖、蒽酮、濃硫酸、無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚、氯仿、正丁醇、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、硼酸、氯化鉀 以上試劑均為分析純。

WF-4000型常壓微波快速反應(yīng)系統(tǒng) 上海屹堯微波化學(xué)技術(shù)有限公司;UV-765型紫外可見分光光度計(jì)、DZF-6050型真空干燥箱 上海精密科學(xué)儀器有限公司;R201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海申勝生物技術(shù)有限公司;SHI-ⅢD型循環(huán)真空泵，XF-100型粉碎機(jī)，HH-600型三用恒溫水浴鍋，TDL-5A型低速離心機(jī)，250D型數(shù)顯光照培養(yǎng)箱，立式高壓蒸汽滅菌器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黃山貢菊多糖提取的工藝流程 黃山貢菊→烘干→粉碎→稱重→加水浸泡→微波浸提→過(guò)濾→上清液→濃縮→醇液沉淀→加savage試劑除蛋白→加石油醚除脂肪→乙醇洗滌→真空干燥→貢菊粗多糖

1.2.2 貢菊多糖的微波浸提與純化 精密稱取黃山貢菊5.0g，加入一定量的蒸餾水，置于微波爐中，調(diào)整pH、微波功率和浸提時(shí)間進(jìn)行多糖的提取;取出后冷卻用濾布擠壓過(guò)濾，濾渣用熱蒸餾水洗滌2次，合并濾液，離心分離(4800r/min，10min)，取上清液;將上清液濃縮至1/5體積，加入3倍體積的無(wú)水乙醇，低溫(4℃)靜置24h;將醇沉液離心分離(4800r/min，10min)，沉淀用20mL蒸餾水溶解;加入savage試劑過(guò)夜去蛋白，石油醚去脂肪，沉淀再用乙醇洗滌兩次，真空干燥至恒重，得貢菊粗多糖。按式粗多糖(干重)提取率(%)=M/W×100%計(jì)算粗多糖(干重)得率，式中:M為粗多糖(干重)，W為供試貢菊樣的重量(g)［4］。

1.2.3 貢菊多糖的含量測(cè)定(蒽酮-硫酸法［5］) 精確稱取105℃烘干至恒重的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖10mg，蒸餾水定容至1000mL，分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL置于10mL具塞試管中，各加水補(bǔ)至2.0mL，精密加入硫酸蒽酮溶液(精密稱取蒽酮0.1g，加入80%的硫酸溶液100mL使溶解，即得)6mL，搖勻，置于沸水浴中加熱15min，取出，放入冰浴中冷卻，以相應(yīng)的試劑為空白，在波長(zhǎng)625nm處測(cè)定吸光度，以含量為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線(得回歸方程A=0.0514C+0.1008，R=0.9995)。

將處理好的多糖提取液稀釋成一定濃度，取1.0mL，加水補(bǔ)至2.0mL，按上述步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，同時(shí)做4個(gè)重復(fù)，測(cè)定吸光度，計(jì)算樣品中多糖含量。

1.2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素的研究基礎(chǔ)上，根據(jù) Box-Benhnken模型的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理［8］，選取微波功率(X1)、提取時(shí)間(X2)、料液比(X3)、提取液pH(X4)4個(gè)因素的3個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化黃山貢菊多糖微波浸提工藝。響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素與水平見表1，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素及水平

1.2.5 抑菌實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 實(shí)驗(yàn)菌株來(lái)源和培養(yǎng)基 細(xì)菌:大腸桿菌(Escherichia coli.);金黃色葡萄球菌(StapHylococus aureus)，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)。培養(yǎng)基選用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基［6］。

1.2.5.2 抑菌實(shí)驗(yàn) 多糖溶液配制:用蒸餾水將多糖提取物配成質(zhì)量濃度為500g/L的溶液，用于實(shí)驗(yàn)。菌懸液的制備［6］:按各供試菌培養(yǎng)基配方稱取原料，制成相應(yīng)培養(yǎng)基，滅菌冷卻后接種，然后置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(大腸桿菌和枯草芽孢桿菌在37℃培養(yǎng)24h，金黃色葡萄球菌和蘇云金芽孢桿菌在35℃培養(yǎng)48h)。然后用接種環(huán)分別挑取適量活化好的菌種，用無(wú)菌水制成含菌量為107～108CFU/mL的菌懸液。

抑菌效果實(shí)驗(yàn):采用紙片擴(kuò)散法［7］，取經(jīng)滅菌后的標(biāo)準(zhǔn)濾紙片(直徑為6mm)，用移液槍取20μL多糖溶液注射于濾紙上，將濾紙平貼于平板表面，37℃培養(yǎng)20h后，用游標(biāo)卡尺準(zhǔn)確地作兩次互為垂直的直徑測(cè)定，取平均值即得到樣品的抑菌圈直徑，觀察并測(cè)量抑菌大小，每種多糖溶液對(duì)4種菌分別測(cè)定2次，以無(wú)菌水為對(duì)照液。

最小抑菌質(zhì)量濃度的測(cè)定:采用紙片擴(kuò)散法方法同上，將多糖溶液稀釋成50、25、12.5、10、5、2.5g/L的質(zhì)量濃度梯度［9-10］，以未見抑菌圈的最高質(zhì)量濃度為MIC。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)Box-Benhnken模型的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行了21組實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。實(shí)驗(yàn)1～18是析因?qū)嶒?yàn)，19～21是中心實(shí)驗(yàn)。21個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)分為析因點(diǎn)和零點(diǎn)，其中析因點(diǎn)為自變量取值在X1、X2、X3、X4所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)。利用Design-Expert7.0.3軟件對(duì)表2的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，表3為回歸方程方差分析。由表3可知，經(jīng)回歸擬合后，各因子(微波功率、提取時(shí)間、液料比、pH)對(duì)響應(yīng)值(多糖得率)的影響可用下面二次多元回歸方程表示:Y=-87.61912+0.0784X1+

表3 回歸方程方差分析

從表3的分析結(jié)果來(lái)看，整體模型的“Prob＞F”值小于0.0001，表明該方程模型回歸顯著，模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.9129，說(shuō)明回歸方程的擬合度較好，實(shí)驗(yàn)方法可靠，調(diào)整R2為0.8382，預(yù)計(jì)R2為0.6693，在可信范圍內(nèi)，說(shuō)明該二次回歸方程能夠真實(shí)地反映實(shí)驗(yàn)因素的組合狀況，可用于微波提取貢菊多糖實(shí)驗(yàn)的理論預(yù)測(cè)?；貧w方程各項(xiàng)的方差分析結(jié)果還表明:為顯著性影響因素，一次項(xiàng)和平方項(xiàng)的影響大，交互項(xiàng)影響較小，液料比(X3)和pH(X4)有交互作用。在各影響因素中，浸提時(shí)間影響最大，其次是微波功率和pH，液料比影響最小，不顯著。在所選取的各因素水平范圍內(nèi)，對(duì)結(jié)果的影響排序?yàn)?，浸提時(shí)間＞微波功率＞pH＞液料比。

2.2 因素間的交互作用

根據(jù)回歸方程，利用Design Expert 7.0.3軟件作不同因子的響應(yīng)面圖，微波功率、提取時(shí)間、液料比、pH四個(gè)影響因素及其交互作用對(duì)黃山貢菊多糖得率的影響見圖1～圖4。

圖1 微波功率和液料比的交互作用

圖2 浸提時(shí)間與液料比的交互作用

圖3 浸提時(shí)間和pH的交互作用

圖1～圖4直觀地反映了各因素對(duì)響應(yīng)值的影響，比較這4個(gè)圖可知，浸提時(shí)間(X2)對(duì)黃山貢菊多糖得率的影響最為顯著，表現(xiàn)為曲線最陡;微波功率(X1)與pH(X4)次之，表現(xiàn)為曲線較陡，液料比影響最小，表現(xiàn)為曲線較平坦。微波功率影響最大是因?yàn)槲⒉üβ逝c提取溫度是正相關(guān)關(guān)系，微波功率大，提取溫度高，功率小，溫度低，低溫不利于多糖物質(zhì)的溶出，高溫會(huì)破壞糖苷鍵，所以微波功率在400～460W范圍有最大響應(yīng)值;提取時(shí)間不宜太久，是因?yàn)樵诙虝r(shí)間內(nèi)，延長(zhǎng)提取時(shí)間有利于多糖物質(zhì)的充分溶解，而超過(guò)適宜提取時(shí)間后，則隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，會(huì)增加雜質(zhì)的溶解，加速糖苷鍵的水解，使多糖得率降低;pH對(duì)多糖得率的影響較大，是因?yàn)槎嗵侨芤簽榫彌_液，在酸性或堿性溶液中有一定的溶解性，偏酸性或偏堿性都不利于多糖物質(zhì)的溶解，而在弱酸性溶液中，多糖物質(zhì)有較好的溶解性。

2.3 貢菊多糖提取工藝條件的確定

表4 貢菊多糖的抑菌圈直徑

圖4 液料比和pH的交互作用

為了確定黃山貢菊的最佳微波提取工藝，通過(guò)軟件Design-Expert 7.1.6求解方程，得出了最優(yōu)提取工藝條件為:微波功率532W，浸提時(shí)間22.16min，液料比38.2∶1，pH6.7時(shí)，預(yù)測(cè)的黃山貢菊的多糖得率為6.45%。

為檢驗(yàn)響應(yīng)面法所建立的數(shù)學(xué)模型的可靠性，采用上述最優(yōu)提取條件進(jìn)行多糖的提取實(shí)驗(yàn)，同時(shí)考慮到實(shí)際操作的便利，將提取貢菊多糖的最佳條件修正為:微波功率為530W，浸提時(shí)間為22min，液料比38∶1，多糖浸提液pH為6.7，進(jìn)行5次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得的黃山貢菊多糖的平均得率為6.18%，與理論預(yù)測(cè)值相比，相對(duì)誤差在1.1%左右，在95%置信區(qū)間內(nèi)。因此，采用RSM法優(yōu)化得到的微波提取黃山貢菊多糖的參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

2.4 黃山貢菊多糖抑菌效果

2.4.1 各受試菌的抑菌圈直徑(質(zhì)量濃度為100mg/mL) 貢菊多糖的抑菌圈大小如表4所示。從表4可以看出，當(dāng)質(zhì)量濃度為100mg/mL時(shí)，貢菊多糖對(duì)細(xì)菌的抑菌效果良好，抑菌圈的直徑都在10～18mm間。從總體上看，貢菊對(duì)大腸桿菌的抑菌效果較好些，其抑菌圈直徑最大的為18mm，而對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑是最小的為10mm。

2.4.2 各受試菌的最小抑菌質(zhì)量濃度(MIC) 貢菊多糖的最小抑菌濃度如表5所示，從表5可以看出，貢菊多糖對(duì)四種細(xì)菌的最小抑菌質(zhì)量濃度在10～20mg·mL-1間，存在一定的差異。貢菊多糖對(duì)大腸桿菌和蘇云金芽孢桿菌的MIC較低，為10 mg· mL-1，表明貢菊多糖對(duì)大腸桿菌和蘇云金芽孢桿菌有較好的抑菌效果。

表5 貢菊多糖的最小抑菌質(zhì)量濃度(MIC)

3 結(jié)論

3.1 應(yīng)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化貢菊多糖的微波浸提工藝，確定各因素對(duì)黃山貢菊總黃酮提取得率的影響次序?yàn)?微波功率＞提取時(shí)間＞pH＞液料比，貢菊多糖提取得率的最佳微波浸提工藝參數(shù)為:微波功率為530W，浸提時(shí)間為22min，液料比38∶1，pH為6.7，實(shí)際測(cè)得的黃山貢菊多糖的平均得率為6.18%。

3.2 微波輔助浸提黃山貢菊中的多糖物質(zhì)，可以有效地浸提黃山貢菊溶液中的有效成分，具有操作簡(jiǎn)單、省時(shí)、省電、提取效率高的優(yōu)點(diǎn)。與傳統(tǒng)方法相比，溶劑回流提取法需要長(zhǎng)時(shí)間加熱，回流提取時(shí)間長(zhǎng)，提取效率低，人力消耗大。而微波是一種電磁波，它具有波動(dòng)性、高頻性、熱特性和耐熱特性四大基本特性。利用微波對(duì)黃山貢菊輻射預(yù)處理，經(jīng)水潤(rùn)濕后的貢菊粉中含有極性水分子，它能快速的吸收微波能而均勻地加熱貢菊，水分子的劇烈運(yùn)動(dòng)使貢菊細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞變薄、開孔甚至破裂，減少了擴(kuò)散過(guò)程的阻力，有利于貢菊多糖分子從細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散到細(xì)胞外。因此微波輻射提取法將微波技術(shù)應(yīng)用于中藥有效成分的提取，有良好的發(fā)展和應(yīng)用前景。

3.3 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:貢菊多糖對(duì)細(xì)菌均有一定程度的抑菌活性，顯示出了貢菊多糖存在廣泛抗菌活性，尤其對(duì)大腸桿菌和蘇云金芽孢桿菌有較好的抑菌作用。黃山市貢菊資源豐富，研究其藥理作用和抗菌效果，為開發(fā)和利用黃山貢菊資源提供了依據(jù)。

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Microwave-assisted extraction and inhibitory effects of polysaccharide from Chrysanthemum Morifolium cv.Gongju

XU Jie-xin，F(xiàn)ANG Hong-xia，CHU Wen-jing，WANG Qing-jun
(Life and Environment College，Huangshan University，Huangshan 245041，China)

The polysaccharide from Chrysanthemum Morifolium cv.Gongju were extracted by microwave extraction and designed by response surface method，the content was determined by Phenol-sulfuric acid method.The polysaccharide extracts were used for inhibitory experiments.The results showed that three influence factors of polysaccharide extraction were significant as microwave power，extraction time and pH.The optimum parameters as follows:the microwave power was 530W，the extraction time was 22min，the ratio of liquid and solid was 38∶1 and the pH value was 6.7，the actual polysaccharide extracts rate was 6.18%.The inhibitory trials showed that the polysaccharide from Chrysanthemum Morifolium cv.Gongju had good inhibition effects.Theminimum inhibitory concentration(MIC)of polysaccharides was 10mg·mL-1to Escherichia coli and Bacillus thuringiensis.

Chrysanthemum Morifolium cv.Gongju;polysaccharides;microwave-asisted extraction;inhibitory effects

TS272.5+3

B

1002-0306(2011)09-0280-04

貢菊也稱“黃山貢菊”、“徽州貢菊”，為中國(guó)四大名菊之一。因在古代被作為貢品獻(xiàn)給皇帝，故名“貢菊”，盛產(chǎn)于古徽州今安徽省黃山市的廣大地域?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實(shí)，菊花具有降血壓、消除癌細(xì)胞、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈和抑菌的作用，長(zhǎng)期飲用能增加人體鈣質(zhì)、調(diào)節(jié)心肌功能、降低膽固醇，適合中老年人和一般人群預(yù)防流行性結(jié)膜炎時(shí)飲用;對(duì)肝火旺、用眼過(guò)度導(dǎo)致的雙眼干澀也有較好的療效［1］。微波輔助提取技術(shù)是近年來(lái)新發(fā)展起來(lái)的一種提取方法，相比于傳統(tǒng)的回流提取、索氏提取等方法，具有選擇性高、快速高效、節(jié)能、節(jié)省溶劑、污染小、質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，可以避免長(zhǎng)時(shí)間的高溫引起試樣的分解，已被應(yīng)用于植物活性成分的提取。目前關(guān)于菊花多糖的研究很少，只有一些對(duì)其有效成分的定性分析［3］及其提取物對(duì)羥自由基清除作用和免疫作用的研究［2］，關(guān)于黃山貢菊多糖的微波浸提工藝未見報(bào)道。本文對(duì)黃山貢菊中的多糖進(jìn)行了微波浸提工藝的研究，考察微波功率、浸提時(shí)間、液料比和pH對(duì)多糖提取得率的影響，采用響應(yīng)面法確定了黃山貢菊多糖的最佳浸提工藝，為黃山貢菊資源的深入開發(fā)提供了理論依據(jù)。

2010-09-25

徐潔昕(1974-)，女，講師，碩士，研究方向:中藥成分提取、藥物分析。

安徽省人事廳海外人才引進(jìn)項(xiàng)目(2008Z040);黃山學(xué)院校級(jí)課題(2007xkjq024)。